I群禽腺病毒4型IgG抗体间接ELISA检测方法的建立

张启龙，孙丹，韦海涛，宋彦军，周德刚，冯小宇，王林*

(1.北京市动物疫病预防控制中心，北京 102629；2.北京市兽药监察所，北京 102629)

肝炎-心包积液综合征(Hepatitis and hydropericardium syndrome，HHS)是由禽腺病毒4型(Fowl adenovirus serotype 4, FAdV-4)新基因型引起的以禽心包积液、肝脏黄染、肿大和出血为特征的传染病[1]。HHS首次于1987年在巴基斯坦的安卡拉地区发生，又名安卡拉病，随后在亚洲、欧洲和南美洲等地区流行[2-4]。2013年以来该病在我国河南、山东、江苏、河北、陕西等地大面积流行，给家禽养殖业造成了巨大经济损失[5-7]。FAdV-4属于禽腺病毒Ⅰ群，呈二十面体对称结构，病毒粒子大小在70～90nm[8]。FAdV-4病毒粒子有252个衣壳粒，包含240个六邻体(Hexon)和12个五邻体(顶点衣壳粒)[9]。研究表明，Hexon蛋白是特异性抗原决定簇，可以引发极强的中和反应，当六邻体发生变异将导致中和免疫的缺失，可作为诊断型和群的首选蛋白[10-11]。FAdV-4的Hexon抗原表位主要集中在前段、中段，推测其具有型和群特异性表位[12-13]。为此，本试验利用前期重组表达的FAdV-4 Hexon蛋白作为包被抗原，通过一系列条件的优化，建立I群FAdV-4 IgG抗体间接ELISA检测方法，为临床检测和有效防控提供技术支撑。

1 材 料

1.1 抗原与对照抗体 纯化重组Hexon蛋白，由北京市动物疫病预防控制中心制备；I群FAdV-4 IgG阴、阳性对照抗体，由河北农业大学提供。

1.2 试剂 0.05 mol/L PBS、PBST均购自Thermo Scientific公司； HRP-兔抗鸡二抗购自Sigma公司；底物溶液购自湖州生物技术有限公司；PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3 临床样品 临床样品由北京市动物疫病预防控制中心采集。

2 方 法

2.1 FAdV-4抗体间接ELISA操作基本方法 将纯化的重组Hexon蛋白用0.05 mol/L的碳酸盐缓冲液稀释后包被96孔酶标板，每孔100 μL，37 ℃孵育5 h后2～8 ℃作用14～18 h。弃去孔中的包被液，每孔加入250 μL PBST洗涤酶标板5次，每次3 min。按每孔200 μL加入封闭液，37 ℃封闭2 h后弃去，每孔加入250 μL PBST洗涤酶标板1次，每次3 min。加入待检样品，100 μL/孔，37 ℃孵育30～120 min。弃去液体，每孔加入250 μL PBST洗涤酶标板5次，每次3 min。加入稀释的HRP-兔抗鸡二抗，100 μL/孔，置37 ℃孵育30～120 min。弃去液体，每孔加入250 μL PBST洗涤酶标板5次，每次5 min。每孔加入底物显色液100 μL，37 ℃避光显色5～15 min，然后每孔加入2 mol/L H2SO4溶液50 μL，终止反应。利用酶标仪测定每孔OD450nm吸光值。

2.2 抗原最佳包被浓度及最佳样品稀释度的确定

用棋盘法对重组Hexon蛋白包被浓度和FAdV-4 IgG抗体阴、阳性对照稀释度进行优化：包被液浓度从8 μg/mL倍比稀释至0.5 μg/mL，100 μL/孔。FAdV-4 IgG抗体阴、阳性对照分别以PBST做1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600稀释，做方阵试验。根据P/N值(阳性样品OD450nm/阴性样品OD450nm)筛选出抗原最佳包被浓度和样品最佳稀释度。

2.3 最佳封闭液的选择 在不包被Hexon蛋白和包被Hexon蛋白后，分别以1%牛血清白蛋白(BSA)、5%脱脂乳、10%马血清和1%明胶作为封闭液进行封闭。检测FAdV-4 IgG抗体阴、阳性对照，根据P/N值选择最佳封闭液。

2.3.1 直接封闭 不包被任何蛋白，每孔加入300 μL相应封闭液，37 ℃封闭2 h。

2.3.2 包被后封闭 以1 μg/mL的纯化重组Hexon蛋白包被ELISA板，分别用不同的封闭液封闭，每孔加300 μL，37 ℃封闭2 h。

2.4 样品孵育时间的优化 将FAdV-4 IgG抗体阴、阳性对照的孵育时间设置30 min、60 min、90 min、120 min四个梯度，分别进行FAdV-4 ELISA试验，根据P/N值结果筛选出最佳样品孵育时间。

2.5 HRP-兔抗鸡二抗最佳工作浓度的测定 将HRP-兔抗鸡二抗分别进行1∶2000、1∶4000、1∶8000和1∶16000倍稀释，按照以上操作程序进行FAdV-4 ELISA试验，根据P/N值结果筛选出二抗最佳工作浓度。

2.6 HRP-兔抗鸡二抗最佳孵育时间的优化 将二抗以1∶8000稀释后分别孵育30 min、60 min、90 min、120 min，按照以上操作程序进行FAdV-4 ELISA试验，根据P/N值结果筛选纯化二抗最佳工作时间。

2.7 底物(TMB)反应时间的优化 将底物的作用时间分别设置为5 min、7 min、10 min、15 min，按照以上操作程序进行FAdV-4 ELISA试验，根据P/N值结果筛选出底物最佳作用时间。

2.8 临床样品检测 采集160只临床鸡只血清进行新建间接ELISA方法检测，同时对鸡只采集拭子依据《Ⅰ群血清4型禽腺病毒核酸PCR检测技术规程》(DB 34/T 3121-2018)进行PCR检测，对比两种方法的一致性。

3 结果与分析

3.1 抗原最佳包被浓度及最佳样品稀释度的确定

不同浓度的抗原和不同稀释度的FAdV-4 IgG抗体阴、阳性对照按正交试验的方法进行组合，每组设置2个重复取平均值。由表1可知，在抗原包被浓度为1 μg/mL，FAdV-4 IgG抗体阴、阳性对照稀释400倍时，P/N值最大，非特异性最小，试验的灵敏度最高，所以确定包被抗原的浓度为1 μg/mL，FAdV-4 IgG抗体阴、阳性对照稀释400倍时检测效果最佳。

表1 包被浓度和样品稀释度的确定

3.2 最佳封闭液的选择 如表2所示，在不包被任何蛋白的情况下，用1%明胶、10%马血清封闭时，FAdV-4 IgG抗体阳性对照的OD450nm值较高，都在0.5以上，表明FAdV-4 IgG抗体阳性对照与封闭液之间存在非特异性结合。而用5%脱脂奶和1% BSA封闭时，FAdV-4 IgG抗体阳性对照的OD450nm值基本都在0.2以下，表明FAdV-4 IgG抗体阳性对照与这两种封闭液之间的非特异性结合程度较小。在包被Hexon蛋白抗原后，用1% BSA和5%脱脂奶进行封闭，阴阳性区分明显，表明1% BSA和5%脱脂奶作为封闭液时对抗原抗体特异性结合干扰较小，选择P/N值较大的1% BSA作为最佳封闭液。

表2 最佳封闭液的确定

3.3 样品孵育时间的优化 在以上优化的基础上，按确定的抗原包被条件、样品稀释度及最佳封闭液，将抗原和抗体作用的时间分别设为30 min、60 min、90 min和120 min，其他条件相同，选择样品最佳孵育时间。结果见表3，发现样品作用时间为30 min时P/N值最小，作用60 min、90 min和120 min时P/N接近，考虑到ELISA反应时间越短越便利，因此选择60 min为最佳样品孵育时间。

3.4 HRP-兔抗鸡二抗最佳稀释度的确定 将酶标二抗按1∶2000、1∶4000、1∶8000和1∶16000倍稀释加入酶标板中，其他条件相同，选择最佳二抗稀释度，结果发现HRP-兔抗鸡二抗稀释度为1∶8000时，P/N的比值最大，因此HRP-兔抗鸡二抗抗体的最佳稀释度为1∶8000，结果见表4。

3.5 HRP-兔抗鸡二抗最佳反应时间的确定 在以上优化的条件下，试验酶标二抗不同孵育时间的P/N值。结果如表5所示，当酶标二抗反应时间为60 min时，P/N值最大，因此酶标二抗最佳反应时间为60 min。

3.6 底物(TMB)显色时间的确定 结果如表6显示，当显色反应为10 min时，P/N的值最大，因此底物(TMB)最佳显色时间为10 min。

3.7 阴、阳性标准临界值的确定 取50份FAdV4抗体为阴性的血清样品，按照确定的条件进行间接ELISA，用酶标仪在450 nm波长下测定OD值，计算OD450nm的平均值及标准方差(s)，为消除每次间接ELISA检测时，试验环境及操作的影响，每次检测时加入标准阳性血清和标准阴性血清作为对照，阳性血清OD450nm约等于1.0，否则结果无效；经计算，50份阴性血清OD450nm的平均值为0.174，标准差s为0.0764，因此间接ELISA阴阳性的临界值(平均值+3s)为0.403(表7)，为计算方便定为0.4。因此，当样品OD450nm≥0.4时，判定I群FAdV抗体水平为阳性，当样品OD450nm<0.4时，判定I群FAdV抗体阴性。

表3 样品反应时间的优化

表4 HRP-兔抗鸡二抗最佳稀释度的确定Tab 4 Determination of the optimal dilution ofHRP- rabbit anti - chicken secondary antibody

表5 HRP-兔抗鸡二抗最佳反应时间的确定Tab 5 Determination of HRP- rabbit anti-chickensecond antibody optimal reaction time

表6 底物最佳显色时间的确定

表7 阴阳性标准临界值的确定Tab 7 Determination of negative and positive standard critical value

3.8 临床样品I群FAdV-4抗体的检测 对160份临床鸡血清样品，按照确定的条件进行间接ELISA检测以及拭子PCR检测，结果见表8。经分析统计两者kappa值为0.924(P<0.001)，结果表明两种检测方法一致性较好。160份血清样本用建立的间接ELISA进行检测有46份样本为阳性，血清阳性率为28.75%，说明北京市部分鸡群中存在I群FAdV-4感染。

表8 两种方法检测临床样品的一致性结果

4 讨论与结论

HHS是主要由FAdV-4引起的一种具有高度传染性和高死亡率的新型家禽疾病。2000年前后，国内报道的FAdV病毒的血清型主要为1型、2型、8型、9型、10型和12型。2012年FAdV-4引起的HHS在我国许多地区零星散发，2013年呈现出暴发式增长[14-16]，2015-2018年国内报道的FAdV的血清型仍然主要是4型[17-20]。

FAdV-4病毒衣壳蛋白主要由六邻体、纤突蛋白、五邻体和五邻体周围蛋白等构成。六邻体是腺病毒最丰富的结构蛋白，含有大量的型特异性抗原，同时也是病毒对免疫压力最弱的地方[21]。本研究利用前期分离到I群FAdV-4 新基因型克隆表达的Hexon蛋白作为包被抗原，建立了FAdV-4 ELISA检测方法，并对该检测方法的各个步骤进行了条件优化，确定该检测方法的最适条件：样品稀释400倍检测；抗原最佳包被浓度为1 μg/mL；最适合的封闭液为含1% BSA的磷酸盐缓冲液；最合适的样品孵育时间为1 h；最适合的二抗稀释浓度和反应时间为1∶8000稀释反应1 h；最适合的底物显示时间为10 min。取50份FAdV4抗体为阴性的血清样品进行ELISA检测，通过平均值+3s的方法计算确定本ELISA方法的临界值为0.4。

目前国内I群FAdV-4尚没有相关血清学检测标准，根据专业知识，血清学检测与病原学检测存在较大相关性，故本研究在临床样品检测阶段与现有PCR方法进行了一致性比较，结果较好。在当前我国尚未使用疫苗对HHS进行普遍防疫的情况下，加强HHS血清流行病学调查，可为HHS早期有效的防控措施提供指导。ELISA具有快速、可操作性强、高通量等优点，常被作为血清流行病学调查的主要方法。部分临床样品检测表明北京市鸡群存在FAdV-4感染，应当引起重视，及时采取有效防控措施。