UPLC法同时测定桃金娘果中4种酚类成分

银慧慧，刘伟，赵武，孟菲，姜源明，覃振华，孙建华

(广西壮族自治区兽医研究所，广西兽医生物技术重点实验室，南宁 530001)

桃金娘[Rhodomyrtustomentosa(Ait.) Hassk.]，又名稔子树、豆稔等，是一种优良的野生药用植物资源[1-3]，我国台湾、福建、广西、广东以及云南等南方地区较为常见，在日本、菲律宾、印度以及马来西亚等国家也有分布。桃金娘全株可入药，具有除湿祛风、去瘀止血、止痛等功效，在《兽药国家标准(化学药品、中药卷)第一册》(中国兽药委员会，2013)中已收录了桃金娘根，而其他部位尚未有统一标准。桃金娘果实中富含黄酮、多酚以及多糖等多种活性成分，在饮料、酿酒以及保健品等方面都逐渐得到了开发应用[4-6]。桃金娘果中已知的酚类物质有没食子酸(Gallic acid, GA)、鞣花酸(Ellagic acid, EA)、白皮杉醇(Piceatannol, PICE)和白藜芦醇(Resveratrol, RES)等[7-8]。目前，对于这4种酚类物质的检测方法主要有紫外分光光度法(UV)[9]、高效液相色谱法(HPLC)[10]和高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS)[11-12]等。UV法较为繁琐，灵敏度低，重现性差；而HPLC法同时测定多种酚类物质耗时较长，试剂消耗大；HPLC-MS法虽然灵敏度和准确度高，但检测费用较高、普及率低。基于前期基础，研究建立了一种快速、简便分离测定桃金娘果中没食子酸、鞣花酸、白皮杉醇、白藜芦醇的超高效液相色谱法(UPLC)，为桃金娘果药材质量标准的制定提供科学依据，促进野生桃金娘资源得到更有效的开发和利用。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 Waters Acquity UPLC带二级管阵列检测器(PDA)，EmpowerTM3色谱工作站，配Waters CORTECS®UPLC®T3色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.6 μm)(美国waters公司)；SK7200HP型超声波清洗器(上海科导)；Milli-Q超纯水仪(Millipore公司)。

没食子酸对照品(中国食品药品检定研究所，110831-201204，含量89.9%)；鞣花酸对照品(中国食品药品检定研究所，111959-201602，含量89.3%)；白皮杉醇对照品(北京索莱宝科技有限公司，10083-24-6，HPLC≥98%)；白藜芦醇对照品(中国食品药品检定研究所，110877-201703，含量99.4%)；0.2 μm混合滤膜(美国waters公司)；桃金娘干果(产地广东梅州、广西桂林和广西柳州，经广西植物研究所温放副研究员鉴定为桃金娘的干燥果实)；实验用试剂均为色谱纯，实验用水均为超纯水。

1.2 方法

1.2.1 UPLC检测条件 色谱柱：Waters CORTECS®UPLC®T3色谱柱(2.1 mm×100 mm， 1.6 μm)；流动相：乙腈-0.2%磷酸；梯度洗脱条件：0～2 min， 6%乙腈；2～4 min，6%～20%乙腈；4～10 min，20%～60%乙腈；10～12 min，6%乙腈；检测波长：280 nm；流速：0.2 mL/min；柱温：35 ℃；进样体积5 μL。

1.2.2 标准溶液的配置 准确称取没食子酸、鞣花酸、白皮杉醇、白藜芦醇对照品置于不同棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别制成没食子酸浓度为98.7 μg/mL、鞣花酸浓度148 μg/mL、白皮杉醇浓度121 μg/mL、白藜芦醇浓度90.2 μg/mL的对照品溶液；实验时，分别用甲醇依次稀释配制成不同浓度的标准工作液，过0.2 μm滤膜后使用。

1.2.3 供试品溶液配置 将桃金娘干果打粉，过筛，得到的样品粉末置烘箱中烘干至恒重，置干燥器中储存；准确称取1.0 g桃金娘果粉末置于具塞锥形瓶中，准确加入30 mL甲醇，称定重量，超声(350 W，53 kHz，40 ℃)提取40 min，放冷，补重，过滤，置于棕色容量瓶中保存，过滤膜。

2 结果与分析

2.1 色谱行为 吸取一定量含没食子酸浓度为49.4 μg/mL、鞣花酸浓度74.0 μg/mL、白皮杉醇浓度60.6 μg/mL、白藜芦醇浓度45.1 μg/mL的混合对照品溶液，按1.2.1节色谱条件，在190～400 nm进行紫外波长扫描，得到的紫外光谱图如图1所示。没食子酸、鞣花酸、白皮杉醇、白藜芦醇对照品溶液和桃金娘干果(广西桂林)供试品溶液的色谱图分别见图2、图3，在1.2.1节的梯度洗脱条件下，没食子酸、鞣花酸、白皮杉醇、白藜芦醇能够与样品基质较好分离。

A. 没食子酸; B. 鞣花酸; C. 白皮杉醇; D.白藜芦醇图1 对照品紫外光谱图Fig 1 The ultraviolet spectrogram of reference substance

A. 没食子酸; B. 鞣花酸; C. 白皮杉醇; D.白藜芦醇图2 对照品色谱图Fig 2 Chromatograms of reference substance

1. 没食子酸; 2. 鞣花酸; 3. 白皮杉醇; 4.白藜芦醇图3 桃金娘果样品色谱图Fig 3 Chromatogram of Rhodomyrtus tomentosa(Ait.) Hassk. fruit sample

2.2 方法学考察

2.2.1 方法线性范围 分别精密吸取不同浓度的没食子酸、鞣花酸、白皮杉醇、白藜芦醇对照品溶液进行UPLC测定，以得到的色谱峰峰面积(y)为纵坐标，相应的浓度(x)为横坐标，绘制4种酚类物质的标准曲线。当没食子酸、鞣花酸、白皮杉醇、白藜芦醇浓度在一定范围时，具有良好的线性关系(r>0.9996，如表1所示)。

表1 线性方程、相关系数和线性范围Tab 1 Linear range, related coefficient andcalibration curves

2.2.2 精密度试验 分别对没食子酸浓度为49.4 μg/mL、鞣花酸浓度74.0 μg/mL、白皮杉醇浓度60.6 μg/mL、白藜芦醇浓度45.1 μg/mL的对照品溶液进行11次平行测定，没食子酸、鞣花酸、白皮杉醇、白藜芦醇峰面积的RSD分别为1.6%、2.7%、3.0%、2.5%，迁移时间RSD分别为0.8%、0.2%、0.1%、0.5%。

2.2.3 稳定性试验 精密称取产地为广西桂林的桃金娘干果样品粉末1.0 g，按1.2.3节方法制备供试品溶液，在室温下保存，分别在制备后的0、4、8、12、24、48 h 注入UPLC中进行测定，记录各个时间样品的峰面积。计算没食子酸、鞣花酸、白皮杉醇、白藜芦醇峰面积的相对标准偏差，分别为1.8%、1.6%、2.3%、2.7%，说明样品在48 h内稳定。

2.2.4 重复性试验 准确称取产地为广西桂林的桃金娘干果样品粉末5份，按1.2.3节方法制备样品溶液，在1.2.1节色谱条件下对样品进行测定，根据UPLC测定得到的各个物质的峰面积，计算RSD，得到样品中没食子酸、鞣花酸、白皮杉醇、白藜芦醇峰面积的RSD分别为2.0%、2.3%、2.7%，3.0%，结果显示该方法具有良好的重现性。

2.2.5 检出限 根据IUPAC规定，得到本法测定没食子酸、鞣花酸、白皮杉醇、白藜芦醇的检出限(3σ, n=11)分别为7.55、2.32、63.7、4.59 ng/mL。

2.3.6 回收率试验 精密称取广西桂林的桃金娘果粉末样品，按1.2.3节处理方法制备供试品，将一定浓度的没食子酸、鞣花酸、白皮杉醇、白藜芦醇标准溶液分别添加至样品中，混匀后过滤进行UPLC分析，每个浓度的样品制备3份溶液，根据UPLC分析得到的结果计算回收率和RSD值，结果见表2。4种酚类物质的加标回收率在95.1%～102%之间，RSD为1.5%～2.8%，该法具有较好的回收率和重现性。

表2 没食子酸、鞣花酸、白皮杉醇、白藜芦醇测定的回收率(n=3)Tab 2 Detection recoveries of GA、EA、PICE and RES (n=3)

2.4 样品分析 对不同地区的桃金娘干果样品进行分析，考察各地4种酚类物质的含量差异。精密称取桃金娘干果粉末1.0 g，每个各称取3份平行样，按1.2.3节制备供试品溶液，各进样5 μL，对样品中的没食子酸、鞣花酸、白皮杉醇、白藜芦醇的含量进行分析测定，结果如表3所示，不同地区的桃金娘果4种酚类物质的含量存在一定的差异。

表3 桃金娘果中没食子酸、鞣花酸、白皮杉醇和白藜芦醇的含量测定(n=3)Tab 3 Detection results of GA,EA,PICE and RES in Rhodomyrtus tomentosa (Ait.) Hassk. fruit (n=3)

3 讨论与结论

3.1 UPLC检测条件的优化 同一物质在不同检测波长下具有不同的吸收值。利用PDA检测器对混合对照品溶液进行全波长(190～400 nm)扫描，结果显示没食子酸、白皮杉醇和白藜芦醇在220 nm附近具有较强的紫外吸收，而在该波长下溶剂峰对目标检测物没食子酸的影响较大；此外，鞣花酸在271 nm、白皮杉醇和白藜芦醇在300 nm波长附近也有较强吸收峰，而采用多波长同时检测多种物质时会降低灵敏度低，因此综合考虑，选取中间值280 nm为检测波长。不同色谱柱由于其构型及填充材料的不同对物质的分离效果也不同。分别采用Waters BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)、Waters BEH C18色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)、Waters CORTECS®UPLC®T3色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.6 μm)对对照品以及样品溶液进行分离测定，发现样品经Waters CORTECS®UPLC®T3色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.6 μm)分离得到的色谱图峰形更好，基线更平稳，分析时间更短。此外，流动相也是色谱分析的一个重要影响因素，不同浓度比例的溶剂以及流动相的酸碱度对待测物质的分离程度和色谱峰的峰形有着一定影响。分别比较了乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%磷酸、乙腈-0.1%甲酸和乙腈-0.2%甲酸等流动相体系进行梯度洗脱的分离检测效果。结果显示，流动相为乙腈-0.2%磷酸时，4种酚类物质在色谱柱上的保留效果最佳、灵敏度更高和分离度更好。这是由于没食子酸、鞣花酸、白皮杉醇以及白藜芦醇均为弱酸性物质，磷酸能更好地增加保留利于分离，因此，本研究选择的流动相体系为乙腈-0.2%磷酸，整个分析时间不超过10 min，显著优于现有检测技术方法[13-14]。

3.2 样品预处理的优化 由于酚类物质的结构带有-OH，根据相似相溶原理酚类物质在醇类溶剂中的溶解度较纯水好，因此选择不同浓度的甲醇和乙醇溶剂(甲醇、80%甲醇、60%甲醇、95%乙醇、80%乙醇、60%乙醇)进行提取实验，结果显示，4种酚类物质在甲醇中都具有较好的溶解效果，而且提取液中的杂质对目标成分的干扰较小，因此综合考虑选择甲醇作为提取溶剂。此外，还考察了料液比对提取量的影响，研究结果表明，当料液比大于1∶30时，酚类物质的提取率呈现下降趋势，这可能是由于随着提取溶剂甲醇量的增加稀释了提取样品，或是高浓度甲醇易挥发间接降低了料液比，因此综合考虑，选择1∶30料液比适宜。提取时间对提取率也存在着重要影响，提取时间太短则提取不充分，而提取时间过长又容易产生热效应降低提取率。考察不同超声提取时间对4种酚类物质的提取量的影响，当提取时间超过40 min时，提取量增加缓慢并有缓慢下降的趋势，可能是由于提取时间过长温度过高，降低了酚类物质的溶解度，故选择超声提取时间为40 min。

相较于现有的没食子酸、鞣花酸、白皮杉醇以及白藜芦醇检测方法UV、HPLC和HPLC-MS法，本文建立的同时测定桃金娘果中4种酚类物质含量的UPLC法更为简便、快速、重现性好，检出限达到了ng级，可用于桃金娘果中药材的质量控制及含量测定，为制定桃金娘果药材标准提供参考依据。