藏红花素对大鼠视网膜缺血再灌注损伤的保护作用

常花蕾，朱 娟，杨新光，于敬妮

西安市第四医院(西安710004)

视网膜具有神经纤维层、光感受器和Müller细胞，是中枢神经系统的一部分，对缺血、缺氧损伤及其敏感，当视网膜发生缺血再灌注损伤(Renal ischemia reperfusion injury，RIRI)时，可造成不同程度的视网膜损伤，在血液再通后，视功能反而下降，视网膜损伤加重。RIRI是一个多因素综合作用的结果。以往的研究发现RIRI的机制与炎症反应学说、氧自由基、钙超载、凋亡因素[1]、兴奋性谷氨酸及能量代谢障碍等密切相关。Müller细胞是视网膜在发育过程中自身产生，除具有支持和营养视网膜的功能外[2]，还对视网膜上许多大分子和离子起控制和调节作用。在Müller细胞上存在的一些特定部位能够通过迅速清除细胞外神经递质，调节神经元胞体和突触周围的微环境，发挥视网膜上信号传导调节功能。胶质细胞酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein，GFAP)是Müller细胞内重要的中间丝蛋白，在生理状态下，其表达为阴性。当Müller细胞在视网膜病变或者脱离时，可出现GFAP表达量增加，这说明Müller细胞活化参与视网膜的各种病理性改变[3]。鸢尾科植物藏红花，由多种挥发性化合物和数种非挥发性化合物构成，其中具有药理学活性的代谢物可分为三大类：藏红花素、藏红花苦素、藏红花醛。其中藏红花素是藏红花的有色成分，且是主要成分[4]。我们课题组之前的研究发现藏红花素可通过PI3K/AKT信号转导通路抗缺血再灌注视网膜神经节细胞凋亡[5]。本研究以藏红花素为切入点，通过前房灌注复制大鼠急性视网膜缺血再灌注损伤模型，通过观察视网膜超微结构、测定GFAP来评估藏红花素对视网膜缺血再灌注损伤的保护作用。

材料和方法

1 实验材料 实验对象：健康SD大鼠(由西安交通大学动物实验中心提供)40只，体重200～250 g，雌雄不限，实验动物均排除眼部及全身疾病。主要试剂：兔抗鼠GFAP多克隆抗体购于武汉博士德试剂公司；SP试剂盒、DAB显色剂均购于北京中山生物技术有限公司；藏红花素冻干粉购于美国Sigma公司，藏红花素化学式C44H64O24。

2 实验方法 采用生理盐水将藏红花素冻干粉稀释成浓度为0.5%的藏红花素溶液。利用随机数字表法将大鼠随机分为正常对照组、缺血再灌注模型组、藏红花素给药高、低剂量组(各10只)。正常组不予任何处理，缺血再灌注组造模前3 d每天给予腹腔注射生理盐水10 ml。高、低剂量组在造模前3 d同一时间点分别给予腹腔注射藏红花素50、5 mg/(kg·d)[5]。模型组、藏红花素低剂量组和藏红花素高剂量组采用前房灌注生理盐水升高眼内压法建立RIRI模型。SD大鼠腹腔注射20%水合氯醛/生理盐水溶液(400 mg/kg)，眼表滴用2%丁卡因麻醉，待麻醉满意后将连接生理盐水瓶输液管的4.5号头皮针沿颞侧角膜缘刺入眼前房，5 min内缓慢升高输液瓶至与动物垂直距离为150 cm处，形成110 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)的眼压[6]，可见球结膜苍白，瞳孔对光反射消失，以眼底由红变白作为眼底血管断流视网膜缺血的标志，维持60 min后，降低输液瓶高度至与动物右眼水平，拔除针头，轻压角膜缘，以球结膜恢复血供，瞳孔出现红光反射，视网膜恢复供血作为进入再灌注期的标志，RIRI模型建立成功。造模成功的大鼠进入实验组，造模时角膜穿通伤或造模完毕后形成外伤性白内障的大鼠被淘汰。再灌注24 h后以10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，迅速摘取眼球后在冰环境中环角巩膜缘切开，弃去前节和晶状体，保留眼杯。

3 观察指标及测定方法 ①视网膜透射电镜标本制备。将眼杯在显微镜下剪成1 mm×1 mm大小的组织块，置于2.5%的戊二醛固定液中4℃固定2 h以上；0.1 mol/L磷酸缓冲液浸洗30 min；1%四氧化锇固定液4℃后固定2 h；0.1 mol/L磷酸缓冲液浸洗10 min；乙醇梯度脱水：30%乙醇10 min、50%乙醇10 min、70%乙醇10 min；70%乙醇醋酸双氧铀块染2 h或过夜；90%乙醇10 min×2；100%乙醇10 min×3；还氧丙烷置换10 min；环氧树脂Epon812浸透、包埋，聚合后作半超薄切片1～2 μm，美兰染色后光学显微镜下定位，瑞典LKB-Ⅴ型超薄切片机进行超薄切片50～70 nm；醋酸铀、柠檬酸铅染色后，日本日立H-600透射式电子显微镜下观察、拍照。②视网膜GFAP免疫组织化学染色SP法。烤片：石蜡切片入电热恒温培养箱60℃，过夜；常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水：二甲苯I 20 min，二甲苯II 20 min，100%乙醇I 10 min，100%乙醇II 10 min，95%乙醇 5 min乙醇80% 5 min，70% 乙醇5 min；抗原修复：置0.01 mol/L枸橼酸缓冲液(pH 6.0)中用煮沸(95℃，15～20 min)，自然冷却20 min 以上，间隔10 min，反复1～2次，0.01 mol/L PBS冲洗3×5 min；灭活内源性过氧化物酶：新鲜配置的3% H2O2室温孵育10 min，PBS冲洗3×5 min；正常羊血清工作液封闭，室温孵育10 min，倾去不洗；滴加一抗4℃冰箱孵育过夜；PBS冲洗3×5 min；滴加生物素标记二抗，室温孵育30 min；PBS冲洗3×5 min;滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，室温孵育30 min；PBS冲洗3×5 min;DAB/ H2O2反应染色；自来水充分冲洗；干燥，封片。③染色结果分析。染色结果采用Motic Med6.0数码医学图像分析系统(厦门麦克奥迪有限责任公司)，每张切片随即选取5个高倍视野(×400)，测定积分光密度值。

结 果

1 再灌注24 h大鼠视网膜内核层超微结构 A示正常组，Müller细胞较周围细胞电子密度高，细胞核呈V字形，或多角形，核染色质较均一，核周细胞质较少，胞体的细长突起深入周围的细胞间(图1A)。B示缺血再灌注组，Müller细胞电子密度较周围细胞高，细胞排列紧密数目较前组增多，部分细胞体积显著增大，胞体变圆，细胞大小不一，胞体突起丰富(图1B)。C示藏红花素高剂量组大鼠视网膜，Müller细胞与正常组类似，细胞核呈梭形(图1C)。说明给予高剂量的藏红花素腹腔注射可以减少视网膜Müller细胞结构变化。D示藏红花素给药低剂量组大鼠视网膜电镜结果，Müller细胞结构与缺血再灌注组类似，细胞电子密度较高，数量较多，Müller细胞的细长突起位于周围的细胞间(图1D)。说明给予低剂量藏红花素不足以影响视网膜上Müller的细胞数量。

A示正常组：Müller细胞核呈V字形(×3000)；B示缺血再灌注组：大鼠视网膜Müller细胞数目较前组增多，体积增大(×3000)；C示藏红花素给药高剂量组：大鼠视网膜Müller细胞与正常组类似，细胞数目较缺血再灌注组少；D示藏红花素给药低剂量组：大鼠视网膜Müller细胞结构与模型组类似，Müller细胞的细长突起包饶旁边的细胞(×3000)；↑示Müller细胞胞体

图1 再灌注24 h大鼠视网膜内核层超微结构

2 再灌注24 h大鼠视网膜Müller细胞超微结构 A为正常组，Müller细胞内核糖体数量丰富，核染色质均一(图2A)；B为缺血再灌注组，Müller细胞核增大变圆，细胞质内可见大量游离核糖体，中间丝蛋白成束排列位于细胞核周围(图2B)；说明在急性高眼压环境下，视网膜Müller细胞核较正常情况下增大，胞质内中间丝蛋白增多。C组为藏红花素给药高剂量组，Müller细胞结构与A组类似，细胞质内含有丰富的粗面内质网及核糖体，细胞核较大(图2C)。这说明给予高剂量藏红花素后视网膜Müller细胞内中间丝蛋白较缺血再灌注组减少。D为藏红花素给药低剂量组，Müller细胞质内可见中间丝蛋白成束排列，大量核糖体附着在内质网上(图2D)。这提示，予低剂量藏红花素腹腔注射，对Müller细胞内中间丝蛋白量不产生影响。

3 视网膜石蜡切片GFAP免疫组织化学法染色结果 A示再灌注24 h后大鼠视网膜矢状位切片GFAP免疫组织化学染色结果，GFAP染色阳性为棕黄色团块状或颗粒状，位于细胞浆内。正常大鼠视网膜GFAP阳性染色位于神经节细胞层，阳性染色颗粒主要位于星形胶质细胞的胞体(图3A)。在缺血再灌注损伤作用下，神经纤维层GFAP阳性染色加重，且于内核层出现阳性染色(图3B)。藏红花素给药高剂量组GFAP表达量与正常组类似(图3C)。藏红花素给药低剂量组GFAP表达量与缺血再灌注组GFAP表达量类似(图3D)。

A示正常对照组：Müller细胞内核糖体(↑)(×20000)丰富；B示缺血再灌注组：Müller细胞核(☆)光密度高，核大，胞质可见成束的中间丝(↑)(×25000)；C示藏红花素给药高剂量组：Müller细胞结构与A组类似，可见大量粗面内质网及核糖体(↑)(×25000)；D示藏红花素给药低剂量组：可见Müller细胞内丰富的核糖体(☆)，及成束的中间丝(↑)(×25000)

图2 再灌注24 h候大鼠视网膜Müller细胞超微结构

A示正常组对照组：仅见视网膜节细胞层有微量棕黄色颗粒染色；B示缺血再灌注组：可见节细胞层及内核层大量棕黄色颗粒状染色；C示藏红花素给药低剂量组：GFAP的表达情况类似正常组，仅见节细胞层少量表达；D示藏红花素给药高剂量组：GFAP主要表达于节细胞层及内核层(ONL 外核层，INL内核层，GCL节细胞层)。GFAP阳性染色为棕黄色，呈颗粒、团块状位于胞质内(↑)

图3 再灌注24 h大鼠视网膜GFAP免疫组织化学染色结果

4 GFAP免疫组化染色积分光密度值比较 见表1。再灌注24 h后，模型组和藏红花给药低剂量组视网膜组织中GFAP表达量较对照组及藏红花给药高剂量组增加，单因素方差分析结果提示各组之间存在统计学差异(P<0.05)；SNK法两两比较，对照组和高剂量组之间有统计学差异(P<0.05)，模型组和低剂量组之间有统计学差异(P<0.05)，对照组、高剂量组与模型组、低剂量组之间比较差异有统计学意义(P<0.05)。

表1GFAP免疫组化染色积分光密度值比较

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与RIRI模型组比较，△P<0.05；与低剂量组比较，▲P<0.05；与高剂量组比较，#P<0.05

讨 论

Müller细胞是哺乳动物视网膜中主要的神经胶质细胞之一，占视网膜细胞总量的90%左右。在胚胎发育过程中与视网膜神经元有着共同的干细胞来源，故其与视网膜的关系密切[7]。在光镜下观察视网膜HE染色切片，区分Müller细胞与其它视网膜细胞很困难。在透射电镜下可清楚地看到Müller细胞胞体主要位于内核层，Müller细核电子密度比周围其他细胞高，呈椭圆形或多角形，染色质颗粒均匀分布。相比细胞核，核周胞质较少且电子密度较大，呈薄薄一层围绕在细胞核周围。在胞质中可见少量细丝、散在分布的圆形线粒体以及囊泡状大小不一的滑面内质网。Müller细胞胞体向视网膜内外侧各分出两个方向相反较粗大的突起，穿过神经视网膜全层，同时内外侧突起还向水平方向发出分支突起，同胞体一样，Müller细胞突起内的胞质的电子密度较高。突起所在的胞质内含有细丝、高尔基体及糖原颗粒，线粒体多集中于突起顶部。

我们的大鼠网膜切片内核层电镜观察结果为：正常组的Müller细胞较周围节细胞电子密度高，细胞体有大量的突起，长短不一的突起分支广泛分布于视网膜各类神经元胞体和神经纤维之间，或贴附在毛细血管壁，细胞质内可见细丝状的胶质纤维酸性蛋白；与对照组相比，缺血再灌注组的结果为Müller细胞数量较前组增多，细胞体积显著增大，分支增多，胞质内中间丝蛋白增多，呈束状排列于细胞核周围；藏红花素高剂量组的Müller细胞及各细胞器形态与正常组接近，低剂量组者与模型组接近。对照正常组和缺血再灌注组的实验结果，可以发现形态学上支持Müller细胞是维持视网膜正常结构的重要骨架的证据：在内核层Müller细胞的突起发出分支环绕周围的神经细胞胞体，这有利于维持视网膜微环境的稳定。同时Müller细胞在维持正常的视网膜谷氨酸代谢、营养支持神经元及保持血-视网膜屏障完整性等方面有着较为重要的作用[8]。

将正常组和缺血再灌注组相比，我们观察到Müller细胞结构的改变主要为细胞肥大，有丝分裂增多，细胞内中间丝蛋白更加丰富。对比藏红花素高剂量(50 mg/kg)和缺血再灌注组可发现，藏红花素使用高剂量组，无论是内核层Müller细胞形态，胞体突起数量及长度还是Müller细胞胞质中核糖体、中间丝的数量均少于对照组，而藏红花素给药低剂量组内核层及Müller细胞形态均与缺血再灌注类似，这说明使用藏红花素高剂量腹腔注射能够有效抑制Müller细胞的活化。

胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是一种相对分子质量为(50～52)×103的胞质内丝状蛋白，是Ⅲ型中间丝蛋白，是Müller细胞的主要骨架蛋白。正常情况下，成熟的大鼠Müller细胞及其终板上均不表达GFAP蛋白，在糖尿病性视网膜病变、缺血等情况下，Müller细胞上GFAP表达量增加，因此GFAP可作为视网膜上Müller细胞反应性活化的重要标志[9]。本研究发现，视网膜缺血再灌注损伤组Müller细胞表达GFAP量较对照组显著增加，藏红花素高剂量组GFAP表达量较模型组低，接近对照组，低剂量组者GFAP的表达量接近模型组。对比各个组GFAP免疫组织化学染色结果可推断，在急性高眼压引起的视网膜缺血再灌注损伤过程中，Müller细胞参与其中并发生活化，表达GFAP增多，使用藏红花素50 mg/kg能够显著降低视网膜GPAP表达量，抑制Müller细胞过度活化。

本实验中，对比缺血再灌注组和藏红花素给药高剂量组，从Müller细胞形态、胞体突起数量及长度、Müller细胞内核糖体及中间丝的数量及GFAP蛋白在视网膜上的表达量上，可以看出，使用藏红花素高剂量腹腔注射能够有效抑制Müller细胞活化。Müller细胞活化是组织对病理损害的防御性反应，本意为组织修复和重塑，促进功能恢复。如果生长因子的分泌足够多，Müller细胞其对外界刺激的反应程度适中则会起到保护作用，若胶质细胞过度活化导致胶质增生或胶质细胞活化的持续时间过长，会造成神经元损伤[10]。但是在Müller细胞活化过程中，其对视网膜组织的保护作用往往小于对视网膜造成的损伤。Müller细胞活化后细胞表面的Kir4通道的减少，使其缓冲细胞外K+的能力下降，发生去极化，从而影响Müller细胞对突触间隙谷氨酸的重摄取能力，使视网膜组织谷氨酸堆积。谷氨酸对光感受器细胞具有神经毒性，谷氨酸大量蓄积能造成视力损害。我们以藏红花为切入点，复制大鼠视网膜缺血再灌注损伤模型，观察发现藏红花素通过抑制Müller细胞过度活化，减轻其对视网膜的损害，从而发挥对视网膜的保护作用。

本研究证实视网膜缺血-再灌注损伤后24 h视网膜组织GFAP蛋白表达显著增加，说明Müller细胞活化在视网膜缺血再灌注过程中发挥作用，藏红花素50 mg/kg可使GFAP表达下调，提示藏红花素能通过抑制Müller细胞过度活化而发挥对视网膜的保护作用。