黄羽肉鸡实验性感染火鸡组织滴虫后体内虫体的动态分布

2019-09-04孔令明禚振男曲昌宝王子静刘丹丹陶建平许金俊

中国预防兽医学报 2019年7期

孔令明，禚振男，郭平，曲昌宝，王子静，刘丹丹，陶建平，许金俊*

(1.扬州大学兽医学院，江苏扬州225009；2.江苏动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州225009；3.诸城市畜牧兽医局，山东诸城262200)

组织滴虫病又称“盲肠肝炎”或“黑头病”，是由火鸡组织滴虫(Histomonas meleagridis)引起的鸡形目禽类的一种原虫病，以肝脏坏死、盲肠肿大和排硫磺样粪便为主要特征，在火鸡群中引起较高的发病率和死亡率[1]。该病的传播需要鸡异刺线虫的参与，禽类也可以通过泄殖腔直接接触病原而感染，肝脏和盲肠是火鸡组织滴虫的主要靶器官[1]。该病在鸡群中感染流行情况也十分严重，在我国很多地区均有不同程度的发生，部分养殖场由于禽舍严重污染，常导致该病暴发，死亡率达到20%～30%，对养鸡业的危害很大[2]。因此，开展组织滴虫病的研究，对于保障养殖业的健康快速发展具有重要的意义。

先前研究结果表明，火鸡组织滴虫可以感染除靶器官以外的禽类其它脏器如心脏、肺脏、肠道和法氏囊等，但结果不尽一致。这些差异与所采用的检测方法的敏感性有一定的关系，且均仅为感染后某个时间点的虫体分布情况[3-5]。探究虫体经人工感染后在禽类体内的动态分布规律，对于该病的临床诊治以及药物和疫苗的研发至关重要，目前相关的研究仅在火鸡上有过报道[6]。黄羽肉鸡在我国华东及南方地区的饲养范围广、数量多，组织滴虫病发病率较高[2]，本研究对15日龄苏禽黄羽肉鸡泄殖腔感染火鸡组织滴虫JSYZ-A株，通过PCR技术对感染虫体后鸡体内的火鸡组织滴虫动态分布进行了研究，为进一步探究组织滴虫病的致病机理、开展药物和疫苗的研制奠定了一定基础。

1 材料与方法

1.1 虫株及实验动物火鸡组织滴虫JSYZ-A株为本实验室从江苏省扬州市仪征市某草鸡饲养场暴发组织滴虫病的病鸡肝脏中分离，冻存于液氮，复苏后在含90%M199、10%马血清、11 mg米粉(每10 mL培养液添加量)的培养液中40℃厌氧传代培养；1日龄苏禽黄羽肉鸡100只，购自中国农业科学院家禽研究所育种中心，出壳后即饲喂在严格消毒的适宜环境中，供给充足的水和饲料，饲料和水中未添加任何药物。

1.2 主要试剂 Medium 199(1×)、灭活马血清购自美国Gibco公司；米粉购自美国Sigma-Aldrich公司；台盼蓝染液购自北京索莱宝科技有限公司；DL2000 DNA Marker、LATaqDNA聚合酶购自TaKaRa公司；dNTP mix购自生工生物工程(上海)有限公司；含火鸡组织滴虫18S rRNA基因的阳性质粒pGEM-T-Easy-HM 18S rRNA由本实验室构建并保存。

1.3 人工感染试验对传代培养2 d的火鸡组织滴虫JSYZ-A株经台盼蓝染色后计数，调整浓度到105个/mL，吸取1 mL培养液分装到1.5 mL EP管中，3 000 r/min离心5 min，弃上清，将沉淀轻轻吹匀，放入40℃恒温培养箱中保存备用。将15日龄苏禽黄羽肉鸡分为两组，其中70只经泄殖腔接种虫体105个/羽作为感染组，30只接种培养基作为阴性对照。

1.4 组织样品的采集感染后定期观察鸡群临床症状并做记录。感染后第1 d开始每隔3 d迫杀5只感染组肉鸡，同时每次迫杀2只对照肉鸡，观察其大体病理变化，采集其脑、心脏、肺脏、脾脏、法氏囊、肝脏、胰脏、腺胃、十二指肠、空肠、盲肠、直肠等组织器官。分别取0.2 g的组织器官样品于高压灭菌的EP管冻存。

1.5 黄羽肉鸡组织脏器内虫体的PCR检测采用酚-氯仿-异戊醇方法常规提取肉鸡组织样品DNA。按照参考文献[7]设计火鸡组织滴虫18S rRNA基因引物：F1：5'-GAAAGCATCTATCAAGTG GAA-3'/F2： 5'-GATCTTTTCAAATTAGCTTTAAA-3'，引物由北京六合华大基因公司合成。对提取的组织DNA进行PCR扩增，以pGEM-T-Easy-HM 18S rRNA为模板作为阳性对照。25 μL反应体系包括：10×PCR Buffer 2.50 μL，10 mol/L dNTPs 2.00 μL，10 μmol/L F1 和 F2 各 2.00 μL，50 ng/μL LATaq DNA 聚合酶 0.25 μL，50 ng/μL DNA 模板 5.00 μL，ddH2O 11.25 μL；反应条件为：95℃ 2 min；95℃35 s、57℃35 s、72℃45 s，40个循环；72℃5 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果与讨论

2.1 临床症状观察黄羽肉鸡接种火鸡组织滴虫后，感染组和对照组鸡均未出现死亡。但感染组鸡出现精神沉郁，食欲减退，缩头垂翅(图1A)、被毛蓬乱无光泽、呆立或聚堆，拉稀、黄绿色稀粥状粪便、恶臭，饮水量增加，症状在第7 d左右开始出现，第16 d左右最为明显，而后逐渐恢复正常。对照组未见异常症状。表明人工感染获得成功。

2.2 剖检病变观察黄羽肉鸡感染火鸡组织滴虫3 d时肝脏呈现轻微肿胀，后出现不明显白色坏死点，随着时间延长，肝脏上白色坏死点数量增多，单个病灶聚集融合成较大的病变，感染后13 d～16 d左右出现中央凹陷且边稍缘隆起的黄白色坏死灶(图1B)，而后逐渐恢复正常。盲肠感染虫体3 d时开始肿大，盲肠壁出血，盲肠内有黄色的散发臭味的液体，盲肠黏膜呈现弥漫性出血、坏死和溃疡，盲肠壁增厚明显，盲肠内形成典型干酪样栓塞，与黏膜粘连，不易剥离(图1C)，感染后13 d～16 d时最为典型，而后逐渐恢复正常。其它脏器和对照组所有脏器均未见异常眼观病变(图1D、1E)。表明黄羽肉鸡人工感染火鸡组织虫后主要引起鸡肝脏和盲肠的损伤。

图1 感染火鸡组织滴虫发病黄羽肉鸡的临床表现和大体病理变化Fig.1 Clinical symptoms and pathological charges of yellow feather broilers infected withH.meleagridis

2.3 黄羽肉鸡组织脏器的PCR检测结果黄羽肉鸡经泄殖腔感染火鸡组织滴虫后定期采集其不同组织脏器样品，提取DNA进行虫体特异性基因PCR检测。结果显示，感染虫体后4 d，部分鸡的盲肠和肝脏中检测到虫体特异性基因，盲肠在感染后13 d检出率最高达到100%，22 d后其检出率降低，一直持续到34 d还能检测到；肝脏的检出率在感染后16 d时达到最高100%，之后的检出率同盲肠类似；十二指肠、直肠和脾脏在感染后10 d～22 d时检测到虫体特异性基因；腺胃和空肠、心脏均在感染后13 d～19 d检测到虫体特异性基因；肺脏在感染后19 d检测到虫体DNA；胰腺、脑、肾脏和睾丸组织在整个实验过程中并未检测到虫体特异性基因(图2)；对照组鸡所有脏器不同时间点检测结果均为阴性。虫体详细动态分布结果见表1。表明火鸡组织滴虫主要靶器官为盲肠和肝脏，也会侵害其它一些脏器，但持续时间较短。

图2 黄羽肉鸡感染火鸡组织滴虫后部分脏器组织虫体18S rRNA基因PCR检测结果Fig.2 Amplification of 18S rRNA in different organs in the yellow feather broilers infected withH.meleagridis

关于火鸡组织滴虫人工感染后虫体在禽体内的动态分布，目前仅见于火鸡。Huber等通过PCR检测了火鸡组织滴虫感染火鸡19 d内每隔3 d体内脏器的分布情况，结果发现肝脏、盲肠、十二指肠、空-回肠、直肠、腺胃和法氏囊均检测到火鸡组织滴虫，肝脏、盲肠存在时间最长，同时脾、肺和脑等组织也检测到了火鸡组织滴虫，在肾脏和胰脏中并未发现火鸡组织滴虫[6]。本研究中虫体存在时间最长的是盲肠和肝脏，腺胃、十二指肠、直肠、空肠、心脏和脾脏中间时间或能够检测到虫体，1周左右，肺脏呈现一过性感染，胰腺、脑、肾脏和睾丸组织未检测到虫体。本次脏器虫体DNA的监测时间长达34 d，虽然结果与火鸡基本一致，但不同时间点除靶器官以外在其余脏器的分布还是存在一定的差异，这与所采用的检测方法的敏感性和人工感染后取材的时间点不同有一定的关系[3-5]。与此同时，由于禽类品种的差异，火鸡比鸡更为易感，感染后诱导机体免疫反应的不同，均会导致脏器虫体的动态分布出现一定的差别[5,8]。另外，鸡的不同品系间的易感性也存在一定差异，如蛋鸡比肉鸡更为易感[9]，伊莎蛋鸡比罗曼蛋鸡更为易感[10]，不同地方品系鸡易感性的差异及人工感染后虫体的动态分布规律，将是我们下一步研究的重点。