球毛壳菌与枯草芽孢杆菌组合对抗黄瓜枯萎病防御酶活性的影响

魏滟洁 田叶韩 王炎峰 高克祥

摘要：黄瓜枯萎病是一种毁灭性的土传真菌病害，其病原菌为尖孢镰刀菌黄瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum），在黄瓜整个生长周期均可发生。本试验研究球毛壳菌（Chaetomium globosum）菌株ND35与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌株J2组合对黄瓜苗期枯萎病的防治效果，并对生防菌处理条件下黄瓜的根系活力、防御酶活性及防御酶相关基因表达进行初步研究。结果显示，球毛壳菌 ND35处理对黄瓜枯萎病的防效为25.36%，枯草芽孢杆菌J2处理对黄瓜枯萎病的防效为54.27%，菌株ND35与菌株J2组合处理对黄瓜枯萎病防效达到70.02%。病原菌胁迫下，生防菌组合处理的黄瓜叶片CAT、SOD、POD、PAL和PPO活性明显提高，峰值分别达91.60、3 239.15、165.80、201.03、256.38 U/gFW;与上述酶活力相关的酶活基因相对表达水平峰值分别为2.94、2.39、5.01、4.49和7.96，分别达到病原菌处理下酶活基因表达量的3.27倍、6.98倍、98%、5.27倍、 2.31倍。组合处理下黄瓜根系活力、平均防御酶活性和相关酶活基因表达水平总体高于单一生防菌处理。综之，生防菌组合对黄瓜枯萎病的防治效果高于单一生防菌防治效果。该结果可为复合微生物防治黄瓜苗期枯萎病提供理论支持。

关键词：黄瓜枯萎病菌;球毛壳菌;枯草芽孢杆菌;根系活力;防御酶

中图分类号：S436.421.1+3文献标识号：A文章编号：1001-4942（2019）07-0072-08

由于黄瓜连年种植以及病虫害积累等一系列原因，黄瓜病害有日趋加重的趋势[1]。尖孢镰刀菌黄瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum）是一种严重危害黄瓜生产的毁灭性土传真菌，可导致黄瓜枯萎病，在世界范围内严重影响黄瓜生产。黄瓜枯萎病一般导致黄瓜减产15%～25%，严重时达到50%以上甚至绝产[2]。

目前，防治黄瓜枯萎病的方法主要有化学防治、农业防治以及生物防治等[3]。化学防治上，蒋荷等[4]通过使用磷酸三钠或甲醛处理黄瓜种子、段广荣等[5]通过使用甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂与多菌灵、甲基硫菌灵复配在防治黄瓜枯萎病上均取得良好防效;农业防治上，丁潮洪等[6]使用黑籽南瓜做黄瓜嫁接砧木防治黄瓜枯萎病。但是，使用化学药剂处理种子可能会对种子造成永久性损伤，长期使用也会对环境造成污染;枯萎病病原菌的变异也会造成品种抗性下降;通过嫁接技术防治枯萎病会存在黄瓜品质下降、嫁接前病菌侵染发病等一系列不可控因素。而生物防治对环境友好、可改善土壤质量、对病原菌特异性强，因此是防治该病措施的重要补充。但是生物防治也有自身的局限，例如使用单一生防菌效果不稳定、抑菌谱较窄、易受环境影响等，所以对于生物防治措施的优化改良也亟待进行。

据研究，相比单一生防菌，合理的生防菌复配具有诸多优点，例如广谱抑菌性、田间作用效果持久、促生效果更加明显等[7，8]。刘苏闽等[9]将毛壳属真菌与多种生防菌复配用于防治草莓枯萎病取得良好效果，刘东岳等[10]将丛枝菌根真菌与根围促生细菌组合用来提高黄瓜枯萎病抗病性。本试验所用生防菌球毛壳菌（Chaetomium globosum）ND35是一株分离自健康毛白杨的内生优势菌株，具有廣谱拮抗性，可产生多种抗生素[11]，能够从植物相邻细胞间隙侵入或在表面形成附着胞，提高植物防御酶活性[12，13]。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）分离自山东农业大学南校区枯萎病试验田，经验证对黄瓜枯萎病具有良好的促生防病作用，并且枯草芽孢杆菌是土壤以及植物微生物生态中的优势菌群，对多种果蔬作物病害具有防治作用，促生作用也十分显著，具有防病效果稳定、对环境人畜无害等一系列优点[14]。本试验将球毛壳菌ND35与枯草芽孢杆菌J2组合防治黄瓜枯萎病菌，探究组合生防菌对黄瓜枯萎病的协同防治机理，为组合生防菌的推广应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试黄瓜品种：津春4号。

生防菌与病原菌：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）J2、球毛壳菌（Chaetomium globosum）ND35、尖孢镰刀菌黄瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum），均由本实验室分离，于PDA斜面4℃保存培养基： PDA、 PDB培养基以及LA、LB培养基。

1.2 试验方法

1.2.1 盆栽条件下不同生防菌处理对黄瓜枯萎病的防病效果 本试验共设置4组处理，分别为枯草芽孢杆菌与病原菌处理（J2+FOC），球毛壳菌与病原菌处理（ND35+FOC），枯草芽孢杆菌、球毛壳菌以及病原菌处理（J2+ND35+FOC），黄瓜枯萎病病原菌处理（FOC），以清水处理为对照（CK）。每个处理3次重复，每重复5盆植株。其他管理措施相同，14 d后统计发病率。

在高17 cm、下底宽14 cm的花盆中装自然土200 g，移栽前3 d加入200 mL孢子浓度为1×107 cfu/mL黄瓜枯萎病病原菌悬浮液。枯草芽孢杆菌J2在28℃、160 r/min培养20 h后，离心重悬浮，向每株黄瓜根部浇灌OD260为1.0～1.1的菌悬液30 mL。球毛壳菌ND35的使用浓度为3×107 cfu/g，其使用方法为将该菌剂与育苗基质混匀，制成每克含有3×107 cfu球毛壳菌孢子的育苗基质，在黄瓜育苗阶段应用。

黄瓜苗期枯萎病分级标准：0级，无症状;1级，真叶、子叶黄化面积或枯萎面积不超过总面积的50%;2级，真叶、子叶黄化面积或枯萎面积超过总面积的50%;3级，叶片枯萎或枯死，仅生长点存活;4级，植株枯死。

病情指数（%）=∑（各级病株数 × 该病级值）/ （调查总株数 × 最高级值）× 100;

防病效果（%）=（对照组病情指数-处理组病情指数）/对照组病情指数 × 100。

1.2.2 黄瓜根系活力测定 取 0.4% TTC 溶液 0.25 mL 放入 10 mL 试管中，加少许Na2S2O4（保险粉）摇匀后立即产生红色的三苯甲腙（TTF），用含25、50、100、150、200 μg的TTF标准比色系列溶液绘制标准曲线，横坐标为吸光值，纵坐标为TTF含量，标准曲线的r2=0.9991，线性关系良好。

称取不同处理的黄瓜根尖0.3 g，放于50 mL锥形瓶中，加入0.4%的TTC溶液和磷酸缓冲液（1/15 mol/L，pH = 7）各5 mL，用保鲜膜封口后在37℃条件下暗处理1 h立即加入1 mol/L硫酸2 mL振荡后静置几分钟以终止反应（同时做空白对照，先加入硫酸，再加入根样品，其他同上）。之后将根取出，吸干水分后放入研钵，加入4 mL乙酸乙酯进行研磨以提取甲腙。将研磨的液体转移至10 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容，使用酶标仪在485 nm波长下测定吸光值。根据测定的吸光值求出所取样品的根系活力，根系活力计算公式如下：

定义每一小时单位质量鲜根的四氮唑还原强度为1个根系活力单位。

单位质量鲜根四氮唑还原强度/根系活力[mg/（gFW·h）]=C/（W·t）。式中，C为根据标准曲线查出的四氮唑还原量（mg）;W为根样品重量;t为反应时间（h）。

1.2.3 黄瓜防御酶活性测定 待黄瓜长到2-3片真叶后进行移栽处理，选择长势一致的植株分别于1、3、5、7、9、11、13 d采集各处理黄瓜叶片3～5 g，分装于锡箔纸中液氮速冻，并放入-80℃下保存，供酶活测定使用。

严格按照试剂盒说明书要求，提取黄瓜叶片组织粗酶液，使用酶活试剂盒（南京建成生物工程研究所）测定PPO、PAL、POD、SOD、CAT的活性。

1.2.4 黄瓜酶活基因表达量测定 采样方法同1.2.3。总RNA的提取、纯化以及RNA的反转录严格按照试剂盒说明书进行。反应体系：cDNA 9 μL、上下游引物各0.5 μL、2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix 10 μL、ddH2O 6 μL。反应条件为：95℃ 3 min;95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，共35个循环;72℃ 10 min。内参基因参照文献[15]，根据引物设计原则使用Primer 5软件设计修饰。每样品重复3次，计算平均循环阈值Ct和标准差。根据2-△△Ct法分析不同处理下黄瓜叶片不同防御酶基因的相对表达量。引物序列信息参照表1。

1.3 数据分析

采用Microsoft Excel 2007作图，用SPSS 19.0统计软件对数据进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理对黄瓜枯萎病的盆栽防治效果

由表1可知，J2+ND35+FOC处理的植株发病率远低于FOC处理。J2+FOC处理和ND35+FOC处理防病效果分别为54.27%和25.36%，J2+ND35+FOC处理防病效果达70.02%。

2.2 不同生防菌处理对黄瓜植株根系活力的影响

由图1可知，黄瓜苗的根系活力在1～3 d略有上升，3～5 d迅速下降，随后趋于平稳。其中J2+ND35+FOC处理3～7 d的根系活力明显高于其它处理，第5 d与FOC处理差异最大，第7 d与J2+FOC、ND35+FOC处理差异最大。空白CK的平均根系活力高于FOC处理，但低于生防菌处理下的根系活力。由此可知，枯草芽孢杆菌J2与球毛壳菌ND35能够减缓根系活力的下降，其根系活力高于对照，并且生防菌组合处理的根系活力明显高于其它处理。

2.3 不同处理黄瓜防御酶活性变化

由图2A看出，J2+ND35+FOC、ND35+FOC和J2+FOC处理的CAT均在第3、7、11 d出现活性峰，其中以第3 d的峰值最高，FOC处理在第3 d达到活性高峰后迅速降低，随后一直保持在比较低的水平。相比FOC处理，J2+ND35+FOC处理在第3 d与其差异最大，CAT酶活性提高34.13%，相比J2+FOC和ND35+FOC处理，CAT酶活性提高16.55%和9.03%。CK处理酶活性一直保持在较低水平且无明显变化。

由图2B可知，不同处理的SOD活性水平具有明显差别，且活性峰值出现的时间不同，其中J2+ND35+FOC处理在第5 d和第11 d出现活性峰，并且总体SOD活性高于J2+FOC、ND35+FOC处理以及FOC处理，处理第5 d时高于FOC处理 33.71%。CK的SOD活性变化不大，但总体高于FOC处理。

由图2C可知， J2+FOC和J2+ND35+FOC处理的POD活性迅速上升，J2+FOC处理在第5 d达到峰值，J2+ND35+FOC处理在第13 d达到活性峰值，但是低于J2+FOC处理第5 d的活性。ND35+FOC处理在第3 d和第11 d形成活性峰，FOC处理在第3 d时POD活性迅速升高随后回落到CK水平，CK的酶活变化不大。在所有处理中，J2+ND35+FOC的POD平均酶活力最高，第13 d时高于FOC处理12.43%。

由圖2D可知，各处理PAL活性在第3 d时形成第一个活性峰。J2+ND35+FOC处理在3～7 d保持较高的PAL活性水平，FOC处理在第5 d和第9 d形成活性峰，且平均酶活性水平略高于CK。J2+ND35+FOC与FOC处理第7 d酶活性差别最大，高于FOC处理10.46%。