一株生产有机硒菌的筛选鉴定及有机硒转化能力测定

郑威+张再起+廖黎娟+刘金龙+戴光忠+杨军

摘要：从烟草废弃物中分离出一株能大量生产有机硒的微生物菌株。采用细菌分离筛选方法选育出单菌种，用无机硒配制发酵液，进行有机硒转化效果试验。用光学显微镜观察菌种形态特征，根据《伯杰氏细菌鉴定手册》进行一系列生理化学反应观察其生理生化特征。应用基因测序技术，确定物种归属。结果表明，该菌为芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）种的新菌株。该菌可将700 mg/L亚硒酸钠全部转化为水溶性有机硒，用于水稻根外喷施，水稻对该发酵液发酵生产的有机硒利用率最高达64.12%，稻米中总硒含量最高达0.432 mg/kg，有机硒占总硒的比例最高达84.9%。

關键词：富有机硒菌；菌种鉴定；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

中图分类号：Q939.99 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）24-6389-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.24.018

硒是人体必需的微量元素之一，必须通过饮食获取，硒广泛分布于机体的各组织器官、体液中，在肾中浓度最高。硒在人体内总量为14～20 mg，具有抗氧化作用（抗辐射、抗炎、抗衰老）、提高免疫功能（抗病毒）、抗癌、维持甲状腺正常功能、促进生殖作用、拮抗重金属、抗糖尿病、抗高血压、保护肝脏、参与蛋白质和酶及辅酶的合成等功效，可预防克山病、大骨节病、心血管病、癌症、糖尿病等40多种疾病[1-5]，与人体健康息息相关，。

由于硒不能在人体长期储存，面对人体内硒的不断流失和摄入不足，机体必须不断从饮食中获得足量的硒，才能维持硒在身体内的平衡。硒浓度的平衡对许多器官、组织的生理功能有着重要的保护和促进作用。目前许多对疾病的化学干预试验已证明硒蛋白在一些重大疾病防治中具有重要作用[6]。

全世界有40多个国家和地区属于缺硒地区。中国存在一条从东北三省斜穿至云贵高原的低硒带，导致占国土面积72%的地区属低硒地区，其中缺硒区占43%，严重缺硒地区占29%，粮食等天然食物硒含量较低，通过使用这些食物不能满足人体对硒的需求[7]。中国近2/3的人缺硒或处于缺硒边缘[8]。中国营养学会推荐硒的日摄入量不能低于60 μg，正常成人日摄入硒的安全和合适范围为60～250 μg，且膳食硒日最高安全摄入量为400 μg[9-11]。

自然界中存在的硒元素分为无机硒和有机硒两种。无机硒一般指亚硒酸钠和硒酸钠等；有机硒是通过生物转化使硒与生物体内有机物质结合而成，一般以硒蛋白、硒氨基酸、硒多糖、硒核酸[12-14]等形式存在。二者都可以被动物吸收利用，但与无机硒相比，有机硒具有使用较安全、吸收利用率高、营养价值高等优点。微生物富硒发酵是利用生物资源对硒开发的一项重要课题，具有广阔的前景。硒多糖、硒蛋白、硒核酸都是易于被动植物吸收的优良补硒剂，具有良好的药理及保健作用。

目前有机硒的获得包括微生物转化法、植物转化法和动物转化法等[15]，微生物转化法中较多的是利用酵母[16]和乳酸菌[17]。在富硒区，仅仅依靠土壤中的硒很难使农产品的硒含量达到标准，必须依靠外源补硒，即通过生物转化来获得有机硒含量较高的农产品，但目前生产上多用亚硒酸钠根外喷施来获得富硒农产品，硒的利用率不高，且转化为有机硒的效率不高，使富硒农产品中有机硒的含量很低。因此，本研究致力于通过微生物提高有机硒转化率，进而为提高农产品中有机硒含量提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与设备 智能发酵罐（镇江东方生物工程设备技术公司）、超净工作台（苏州隆意达净化科技有限公司）、恒温摇床（武汉科学仪器厂）、试管、培养皿、接种环、酒精灯、250和500 mL三角瓶、光学显微镜。

1.1.2 菌种 分离得到具有高无机硒转化为有机硒能力的Ⅲ号菌种。

1.1.3 培养基 葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、琼脂15～20 g、NaCl 5 g、去离子水1 000 mL，pH 7.2～7.4；明胶培养基：NaCl 5 g、蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、明胶120 g，加去离子水至1 000 mL，调节pH 7.2～7.4；糖代谢检测培养基：（NH4）2HPO4 1.0 g、KCl 0.2 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、酵母膏0.2 g、琼脂15 g、溴甲酚紫0.008 g、葡萄糖5 g（可用核糖、果糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇代替），加去离子水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 菌种的分离筛选 采样与样品处理：采集湖北恩施市白杨坪的富硒烟草废弃物，称取1 g样品置于盛有99 mL无菌水的三角瓶中，充分振荡。

分离：采用梯度稀释分离法稀释10-2～10-8倍，从10-6～10-8稀释液中各取0.1 mL均匀涂抹于葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基平板上，每个浓度设3个重复，30 ℃恒温培养24 h后进行观察，挑取不同形态的单一菌落，转接至葡萄糖牛肉膏蛋白胨平板培养基继续培养，挑取分离到的菌落形态不同的5个菌株，并编号为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，进一步纯化。

筛选：将进一步纯化得到的5个菌株进行耐硒性检测，在葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基中加入Na2SeO3（以Se计，下同）300～700 mg/L进行培养，其中Ⅲ号菌株长势良好。

纯化：将Ⅲ号菌株采用平板划线法分离纯化，涂葡萄糖牛肉膏蛋白胨平板检验直至不出现杂菌为止。

1.2.2 菌种的扩大培养 在无菌环境中，挑取两环Ⅲ号菌株的纯化菌种于葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基中扩大培养，30 ℃ 150 r/min培养6～9 h。

1.2.3 发酵培养 于10 L不锈钢自控发酵罐中进行，葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基装料体积为发酵罐容积的70%，0.12 MPa灭菌25 min，待培养基温度下降至35 ℃，接入10% Ⅲ号菌株扩大培养的种子液中，并加入Na2SeO3 300～700 mg/L。

培养条件：设定罐压0.04～0.05 MPa，罐温（30±5） ℃，pH 6.0，溶氧60%～100%，搅拌速度190 r/min，发酵18～24 min得发酵培养液6.5 L。

1.2.4 无机硒转化为有机硒效果研究 将发酵液样品送至湖北航天化学技术研究所分析检测中心依据GB/T 5009.93-2003、GB/T 5009.11-2003进行硒、总砷和无机砷的测定，依据GB/T23942-2009化学试剂 电感耦合等离子体原子发射光谱法通则，采用等离子体原子发射光谱仪检测分析发酵液有机硒含量，参照杭州市农业标准规范DB3301消解无机硒的方法处理样品，测定无机硒。总硒和无机硒的差值为有机硒含量，若未检出无机硒，则总硒即为有机硒。

1.2.5 Ⅲ号菌株的初步鉴定 以《伯杰氏细菌鉴定手册》为指导，参考《一般细菌常用鉴定方法》、《中华人民共和国药典》2015版四部9204微生物鉴定指导原则，对微生物的生理生化性质进行分析，判定出该微生物的种属关系。

1）细胞形态学观察：取纯化的试管斜面，用10 mL无菌水冲洗斜面，获得菌种悬液。吸取稀释后的菌液，进行革兰氏染色、镜检，观察细胞形态。

2）菌落观察：取纯化的试管斜面，用10 mL无菌水冲洗斜面，获得菌种悬液。用浓度梯度稀释法，将菌悬液稀释后涂布到平板培养基上，30 ℃培养24 h形成单菌落，对菌落进行观察。

3）硝酸盐还原性检测：将分离纯化的Ⅲ号菌株接种于硝酸盐培养基中，30 ℃培养1～4 d。将甲（氨基苯磺酸0.8 g，5 mol/L醋酸100 mL）、乙（α-萘胺0.5 g，5 mol/L醋酸100 mL）等量混合液（用时混合）0.1 mL加于试管内，以一支未接种细菌的培养基作为对照。出现红色反应则为阳性，否则为阴性；若对照管为阴性，试验管为阳性，则检测结果阳性；若对照管和试验管均为阳性，则检测结果假阳性。

4）运动性检查：用解剖针穿刺接种分离纯化得到的微生物于葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基内。30 ℃，恒温培养48 h，将培养后的培养皿对透射光目测。微生物只生长在穿刺线上，边缘十分清晰，则表示该菌种无运动性；若生长物不仅生长在穿刺线上且向四周呈云雾状扩散，或穿刺线上生长物很少，从穿刺线表面向下渗入有生长物，则表示该菌种有运动性。

5）接触酶检测：用解剖针挑取培养好的单菌落，涂抹于滴有一滴3%过氧化氢的载玻片上，如果气泡产生则为阳性，若没有气泡产生则为阴性。

6）明胶液化检测：挑取生长良好、大小适中的菌落针刺接种于明胶培养基，另取两支空白培养基试管斜面，用无菌解剖针穿刺。22 ℃培养箱中培养，每隔1 d观察试管斜面菌落生长状况和明胶液化程度。若有明显菌落生长且培养基无明显凹陷或液化，则为阴性；若无菌落生长，明胶凝块部分或全部变为可流动的液体，则为假阳性；若有菌落生长，且明胶有明显液化或凹陷，则为阳性。

7）糖代谢检测和产酸检测：将分离纯化的试管菌种分别接种到加有不同糖类的糖代谢培养基中，观察微生物生长状况和指示剂颜色反应。若微生物正常生长且指示剂变色，则可以判定该微生物颗粒利用此种糖类，且该微生物产酸。

8）Ⅲ号菌种的16S rRNA序列同源性及系统进化树分析：将Ⅲ号纯化试管菌种送往中国典型培养物保藏中心（CCTCC）测序，并将核酸序列检测结果通过NCBI进行BLAST-nucleotide分析，并进行16S rRNA序列同源性比对，选取与其同源性较高的基因序列，构建系统发育树，确定其种属关系。

1.2.6 水稻中有机硒含量的测定 将富硒发酵液梯度稀释后对水稻根外喷施，对水稻植株及大米中硒含量进行检测，分析水稻植株对硒的利用率及大米中的有机硒含量。

2 结果与分析

2.1 菌株SE201412形态学特征

通过观察，革兰氏染色为紫色，即阳性菌，菌株形态特征为杆状，芽孢直径小于1 μm，且菌体不膨大，鞭毛侧生，符合芽孢杆菌形态特征（图1）。通过菌株平板菌落形态观察，该菌落表面粗糙不透明，污白色（图2）。

2.2 生理生化特征

Ⅲ号菌生理生化特征的检测项目及结果如表1所示，具体分析如下。

2.2.1 硝酸盐还原性检测 在试验管中加入混合液3 min后颜色开始变化，8 min后红色变化明显为阳性，对照管颜色始終无变化，为阴性，故检测结果为阳性。即该菌种可以将硝酸盐还原成亚硝酸盐。表明该微生物具有硝酸盐代谢途径，符合枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）生化特点。

2.2.2 运动性检查 培养48 h后对培养皿进行透射光目测。发现微生物不仅生长在穿刺线上，穿刺线边缘不清晰，穿刺线四周也有明显菌落生长。部分穿刺线周围出现雾状菌落，有沿着穿刺线表面向下生长的状况。表明该菌种有运动性，符合枯草芽孢杆菌特性。

2.2.3 接触酶检测 用解剖针挑取培养24 h的单菌落，涂抹于滴有一滴3%过氧化氢的载玻片上，有少许气泡产生，接触酶检测呈阳性。

2.2.4 明胶液化检测 该菌株在22 ℃培养箱中培养，第二天开始出现明显菌落。第三天菌落处出现培养基凹陷。培养观察7 d后，培养基液化达到1 cm，明胶液化呈阳性。表明该微生物具有蛋白酶活性，具有枯草芽孢杆菌明胶液化代谢特点。

2.2.5 糖代谢检测和产酸检测 将分离纯化的试管菌种分别涂抹于阿拉伯糖、核糖、果糖、木糖、甘露醇等糖、醇代谢培养基中，该菌生长状况良好，培养3 d后出现明显菌落，培养基变黄色。故可以判定该微生物可以利用多种糖、醇且该微生物发酵产酸。说明该菌具有阿拉伯糖、核糖、果糖、木糖、甘露醇等糖、醇代谢途径，符合枯草芽孢杆菌的糖代谢和产酸的特点。

2.3 SE201412菌株16S rRNA同源性分析

对菌株SE201412进行16S rRNA基因序列分析（图3）。16S rRNA基因序列长度为1 383 bp。

将SE21412菌株16S rRNA基因序列通过NCBI进行Blast比对，在GenBank中，38个与SE21412菌株同源性较高的菌株比对结果见表2。

利用NCBI在线工具，构建菌株Se201412系统发育树（图4）。菌株SE201412所在最大分支中所包含的全部菌株均为芽孢杆菌属，初步鉴定SE201412属于芽孢杆菌属。且该菌株与Genbank中的登记序列Bacillus subtilis DSM10（AJ276351）的枯草芽孢杆菌同属于一个最小次级分支。并与枯草芽孢杆菌库16S rRNA有99%同源性，因此，鉴定该菌属于枯草芽孢杆菌属，是枯草芽孢杆菌属中枯草芽孢杆菌种的一个新菌株，命名为Bacillus subtilis SE201412。

2.4 加入SE201412菌发酵后无机硒转化为有机硒的效果

SE201412菌通过发酵可将一定比例的亚硒酸钠转化为有机硒，其中，一部分的有机硒溶于发酵液中，一部分被菌合成自身的营养物质。如表3所示，在SE201412菌发酵液中加入亚硒酸钠300～700 mg/L，可以100%转化为有机硒。表明SE201412是嗜硒菌，在高硒浓度下生长良好，有较高的应用价值。

2.5 SE201412发酵富有机硒菌液在水稻生产中的应用

用Na2SeO3根外喷施作物，其利用率不超过20%，80%的硒被浪费，且稻米中有机硒含量不高。SE201412发酵富硒菌液根外喷施水稻植株，水稻植株对硒的利用率为51.26%～64.12%，大米有机硒占总硒比例为83.4%～84.9%（表4）。表明SE201412发酵富硒菌液可以提高亚硒酸钠的利用率，尤其是可生产出达到DBS42/002-2014标准的富有机硒农产品。

3 小结与讨论

本研究通过对从恩施市白杨乡烟草废弃物提取烟碱前处理物中分离得到的一种枯草芽孢杆菌SE201412进行形态、生理生化特征[18，19]、基因序列分析[20]，表明其是一株新的枯草芽孢杆菌菌株，命名为Bacillus subtilis SE201412。该菌株有较强的将无机硒转化为有机硒的能力，利用该菌株生产的富有机硒菌剂可以生产出达标的富有机硒农产品。应用Bacillus subtilis SE201412对亚硒酸钠进行发酵转化，得到的发酵液以不同硒浓度（以Se计）用于水稻根外喷施生产富有机硒水稻，可使水稻有机硒含量最高达0.365 mg/kg，硒的利用率最高达到64.12%，稻米中总硒含量最高达0.432 mg/kg，有机硒占总硒的比例最高达84.9%，具有较高的学术和应用价值。

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