粪肠球菌和枯草芽孢杆菌的体外评价研究

李在建+易维学+操继跃

摘要：测定了粪肠球菌（Enterococcus Faecalis）和枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）对致病性大肠杆菌O54、霍乱沙门氏菌A72及正常菌嗜酸乳酸杆菌CICC6075生长的影响。结果表明，粪肠球菌和枯草芽孢杆菌均可较好的抑制大肠杆菌和沙门氏菌的生长；粪肠球菌对嗜酸乳酸杆菌起到较好的促生长作用；枯草芽孢杆菌与嗜酸乳酸杆菌混合培养的前35 h，对嗜酸乳酸杆菌有一定的抑制作用，但35 h以后则对其有较好的促生长作用。

关键词：粪肠球菌；枯草芽孢杆菌；混合培养；体外评价

中图分类号：S816.7 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）23-6200-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.23.050

Abstract：The effect of E. faecalis， B. subtilis on the growth of Escherichia coli O54（E. coli）， Salmonella choleraesuis A72 （S. choleraesuis） and normal bacterial Lactobacillus acidophilus were studied in this research. The results showed that the growth of E. Coli and S. choleraesuis could be well inhibited by E. faecalis and B. subtilis. E. faecalis could promote the growth of L. acidophilus. However， L. acidophilus could be inhibited by B. subtilis in the pre-35h of mixed culture， and then， they could be promoted growth well.

Key words：E. faecalis； B. subtilis； mixed culture； vitro evaluation

益生菌制剂又名促生素，活菌制剂，益生素。益生素由美國学者Parker于1974首次提出，是与抗生素相对应的新概念，用来表示给动物饲用的微生态制剂，它可以直接饲喂动物并通过调节动物肠道微生态平衡达到预防和治疗疾病，促进动物生长以及提高饲料报酬的活性微生物，从而调整体内微生态平衡[1，2]，有的益生菌制剂还含益生菌在生长过程中产生的代谢产物[3]。某些益生菌不但可以提高饲料转化率和畜禽的生产性能，而且对改善动物健康状况，降低畜禽产品中胆固醇的含量有着很好的作用。此外，微生态制剂可显著减少畜牧生产过程中对环境造成的污染[4]。

乳酸菌和芽孢杆菌能产生多种细菌素，其中大部分能够抑制或杀灭革兰氏阳性菌，另外的极少数则对革兰氏阴性菌和真菌有较好抑制或杀死作用。因此，当治疗革兰氏阴性菌导致的疾病时，筛选能够抑制革兰氏阴性细菌的益生菌具有非常重要的应用价值。本试验通过益生菌和致病菌及有益菌的联合培养，建立细菌联合培养时的生长曲线，探讨粪肠球菌和枯草芽孢杆菌对致病性细菌大肠杆菌O54、霍乱沙门氏菌A72以及肠道正常菌嗜酸乳酸杆菌CICC6075生长繁殖的影响，在体外确证这两种菌在临床应用上的价值。

1 材料与方法

1.1 试剂、药品

胰蛋白胨和酵母提取物为英国OXOID公司产品；TSA和M-H肉汤为英国BD公司产品；葡萄糖购自广东光华化学厂有限公司（批号：20070528）；氯化钠（分析纯，批号：F20070726），二甲亚砜（分析纯，批号：T20080229），均购自国药集团化学试剂有限公司；SS琼脂培养基（批号：20090317-01），伊红美蓝琼脂（EMB）培养基（批号：20090203-02），均由杭州微生物试剂有限公司提供；乳杆菌选择性培养基（LBS，批号：090504），由上海盛思生化科技有限公司提供。

1.2 试验菌株

枯草芽孢杆菌与粪肠球菌，由沧州兴业生物技术有限公司提供；大肠杆菌O54，霍乱沙门氏菌A72由武汉工业学院饲料科学系提供；嗜酸乳酸杆菌CICC6075，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；大肠杆菌ATCC25922，金黄色葡萄球菌ATCC29213由华中农业大学农业微生物国家重点实验室提供。

1.3 细菌的计数方法

本试验采用较为常用的平板活菌计数法，其原理是将待测菌液经适当稀释，涂布在相应的无菌琼脂平板上，置于适宜的条件下培养一定时间，经过培养后在平板上形成肉眼可见的菌落，统计菌落数，根据稀释倍数和取样量计算出原始菌液浓度[5]。

1.4 粪肠球菌和枯草芽孢杆菌繁殖速率的测定方法

首先将复活的菌液1 mL接种到9 mL的灭菌TSB培养基中，混匀后立即开始活菌计数，所测得的菌液浓度为X1，剩余的9 mL菌液置于37 ℃，180 r/min条件下水浴恒温振荡器中培养，计时为T1，培养至时间T2后取出1 mL立即开始活菌计数，所测得的菌液浓度为X2。由于细菌是以二等分分裂法繁殖的，因此细菌的浓度满足关系式：X2=2nX1，则n=3.31（lgX2-lgX1），世代时间G=（T2-T1）×60/[3.31（lgX2-lgX1）]。（G表示世代周期，n表示细菌繁殖的次数）。

2 结果与分析

2.1 粪肠球菌与枯草芽孢杆菌的世代时间测定结果

接种粪肠球菌时所测得菌悬液浓度X1为3.8×104，培养时间约为5 h，此时测得的菌悬液浓度X2为2.3×108。由公式G=（T2-T1）×60/[3.31（lgX2-lgX1）]算得粪肠球菌的世代时间G=23.9 min。

接种枯草芽孢杆菌时所测得菌悬液浓度X1为7.2×104，培养时间约为6 h，此时测得的菌悬液浓度X2为3.5×108。由公式G=（T2-T1）×60/[3.31（lgX2-lgX1）]算得枯草芽孢杆菌的世代时间G=29.4 min。

2.2 饲用益生菌对致病菌和肠道正常菌生长繁殖的影响

2.2.1 粪肠球菌对大肠杆菌O54、霍乱沙门氏菌A72及嗜酸乳酸杆菌CICC6075生长繁殖的影响 由图1可知，从第6 h开始，混合培养体系里的大肠杆菌O54浓度要显著低于其单独培养时的浓度，粪肠球菌对大肠杆菌O54的拮抗作用在12～48 h达到顶峰，后面各时间点测得的菌悬液浓度也存在较大差异，据统计学检验，差异极显著（P<0.01）。由此可以推断出，当大肠杆菌O54和枯草芽孢杆菌在一个混合体系中共同存在时，枯草芽孢杆菌对大肠杆菌O54的生长繁殖具有较好的抑制作用，该株枯草芽孢杆菌具有较好的益生作用。

2.2.2 粪肠球菌对霍乱沙门氏菌A72生长繁殖的影响 由图2可知，从第6 h开始，混合培养体系里霍乱沙门氏菌A72的菌悬液浓度要显著低于其单独培养时的浓度，60 h后其浓度呈急剧下降的趋势，6到60 h的阶段各时间点测得的数目也呈显著差异。各个时间点的菌悬液浓度经统计学检验，差异极显著（P<0.01）。由此可以推断出，当霍乱沙门氏菌A72和糞肠球菌在一个混合培养体系中，在适宜条件下共同培养时，粪肠球菌对霍乱沙门氏菌A72的生长具有较好的抑制作用，该株粪肠球菌具有很好的益生作用。

2.2.3 粪肠球菌对嗜酸乳酸杆菌CICC6075生长的影响 由图3可知，除了第30 h，其他混和培养组的嗜酸乳酸杆菌CICC6075数目就显著比单独培养组的乳酸杆菌数目多，统计学结果表明，各时间点的细菌浓度差异极显著（P<0.01），这表明，粪肠球菌对嗜酸乳酸杆菌CICC6075具有较好的促生长作用。

2.2.4 枯草芽孢杆菌对大肠杆菌O54生长繁殖影响的试验结果 由图4可知，从第6 h开始，混合培养体系里的大肠杆菌O54浓度要显著低于其单独培养时的浓度，后面各时间点测得的菌悬液浓度也有很大差别，据统计学检验，差异极显著（P<0.01）。由此可以看出，当大肠杆菌O54和枯草芽孢杆菌在一个混合体系中共同培养时，枯草芽孢杆菌对大肠杆菌O54具有较好的抑制作用，该株枯草芽孢杆菌具有优良的益生作用。

2.4.5 枯草芽孢杆菌对霍乱沙门氏菌A72生长繁殖影响的试验结果 由图5可知，从第6 h开始，混合培养体系里的霍乱沙门氏菌A72的浓度要显著低于霍乱沙门氏菌A72单独培养时的浓度，60 h后霍乱沙门氏菌A72的浓度呈急剧下降的趋势，6～60 h的阶段各时间点测得的菌悬液浓度较对照组也明显偏低。各个时间点的浓度经统计学检验，差异极显著（P<0.01）。由此可以看出，当霍乱沙门氏菌A72和枯草芽孢杆菌在一个混合体系中，在适宜条件下共同培养时，枯草芽孢杆菌对霍乱沙门氏菌A72的生长繁殖具有较好的抑制作用，证明该株枯草芽孢杆菌具有优良的益生作用。

2.4.6 枯草芽孢杆菌对嗜酸乳酸杆菌CICC6075生长影响的试验结果 由图6可知，在0～5 h阶段，嗜酸乳酸杆菌CICC6075单独培养和混合培养菌悬液浓度非常接近，5～35 h这段时间内，嗜酸乳酸杆菌CICC6075混合培养时的菌悬液浓度较单独培养时小，且差异极显著（P<0.01），但35 h以后混合培养的乳酸杆菌开始迅速大量繁殖，数目迅速增多，到40 h左右菌悬液浓度已经超过了单独培养时的菌悬液浓度，由此可以推断出在生长后期枯草芽孢杆菌对嗜酸乳酸杆菌CICC6075具有较强的促生长作用。

3 讨论

试验结果表明，粪肠球菌和枯草芽孢杆菌对致病性大肠杆菌O54和霍乱沙门氏菌A72有较强的拮抗作用，与对照组相比一般抑制率可达90%以上，对嗜酸乳酸杆菌CICC6075的生长可起到促进作用。该结果在动物活体试验上也得到了验证，易中华[6]用枯草芽孢杆菌和寡聚糖配伍使用，结果表明，它们能显著增加肉鸡盲肠中乳酸杆菌的数量，减少致病性大肠杆菌的数量；闫风兰等[7]通过试验发现两种不同枯草芽孢杆菌均能增加肉鸡肠道中乳酸杆菌的数量；张璐[8]研究发现枯草芽孢杆菌可显著降低14、21日龄肉鸡盲肠中大肠杆菌的数量。薛胜平等[9]研究发现粪肠球菌对大肠杆菌、沙门氏菌的抑制作用分别达到5 000倍、8倍。而王锂韫等[10]从酸马奶酒中分离出来的粪肠球菌对大肠杆菌几乎没有抑制作用。这可能是由于菌株的来源不同导致细菌的特性有一定差别。

粪肠球菌被认为是一种条件致病菌，在人的免疫力低下或有严重通常导致尿路感染、心内膜炎、腹膜炎、伤口感染等疾病[11，12]，但在一般情况下对人体和动物是没有危害的的，属于人和动物体内的常在菌。枯草芽孢杆菌是一种较为安全的细菌，不会对人和动物造成危害。本试验中，粪肠球菌和枯草芽孢杆菌对致病菌的抑制作用可能与它们强大的细菌素分泌功能有关，一些学者研究发现粪肠球菌E.faecalis RJ-Ⅱ、E.faecalis LMG可以产生如细菌素Enterocin RJ-Ⅱ和Enterolysin A之类的细菌素[13，14]，这些代谢性产物可能对致病性的大肠杆菌和沙门氏菌有较好的抑制生长作用。枯草芽孢杆菌通常被认为是一种非致病菌，可以产生如肽类的抗生素枯草菌素和伊枯草菌素之类的细菌素[15]，这些物质可能对大肠杆菌和沙门氏菌有较好的抑制作用。

通过试验发现粪肠球菌和枯草芽孢杆菌对大肠杆菌O54、霍乱沙门氏菌A72生长的抑制作用主要表现在混合培养6 h以后的阶段，这说明只有当粪肠球菌和枯草芽孢杆菌达到较大的菌悬液浓度时且与大肠杆菌O54和霍乱沙门氏菌A72共存于同一培养体系时才具有较好的益生效果。

参考文献：

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