集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803 slr1501的克隆及原核表达分析

张燕 岳寿松 陈高 游银伟 钟怀荣 于金慧

摘要：组蛋白乙酰基转移酶上调表达与抗逆性有一定相关性。集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803 Slr1501是一个未知蛋白，预测其属于组蛋白乙酰基转移酶GNAT家族N-乙酰基转移酶。为了进一步明确slr1501基因功能，本研究从集胞藻6803中克隆slr1501基因，成功构建了pET-28a（+）-slr1501原核表达载体，并转化至大肠杆菌BL21（DE3）进行分析。经1 mmol/L IPTG诱导2 h后Slr1501蛋白成功表达，表达量随诱导时间的延长而增加，且主要以包涵体形式表达。Western blot检测结果显示Slr1501重组蛋白特异性表达。本试验结果为进一步研究该基因的功能奠定了基础。

关键词：集胞藻6803; 乙酰基转移酶; slr1501; 原核表达; 基因功能

中图分类号：S555+.6：Q785文献标识号：A文章编号：1001-4942（2019）07-0001-05

集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803 （以下简称集胞藻6803）归属于蓝藻门集胞藻属，是一种单细胞蓝藻，其基因组序列遗传背景清楚、结构简单，是基因工程研究的模式藻类。Slr1501是集胞藻6803中的一个未知蛋白，根据序列相似性和相应蛋白功能比对结果，预测其为组蛋白乙酰基转移酶GNAT家族N-乙酰基转移酶（http：//bacteria.kazusa.or.jp/cyanobase）。组蛋白乙酰化由组蛋白乙酰基转移酶（histone acetyltransferase，HAT）和组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases，HDAC）共同参与，过程动态可逆。组蛋白乙酰化是表观遗传调控的重要机制，在HAT的作用下，将乙酰基团转移到目标受体氨基酸位点的过程，是细胞控制基因表达、蛋白质活性或生理过程的一种机制[1]。HAT对细胞核内转录调控因子的激活起到非常重要的作用，已证实乙酰化参与原核生物的转录后修饰，涉及转录调控和信号转导蛋白[2]。

集胞藻6803 slr1501与逆境适应相关，如盐胁迫、渗透胁迫、酸胁迫和碱胁迫等[3-7]。当转至pH值为10条件下，集胞藻6803细胞中slr1501转录水平升高;而再次转至中性pH值条件时，slr1501转录水平迅速下降至高pH条件时表达水平的1/40左右，1 h后，检测不到slr1501的表达。这种快速的基因表达反应，目前尚未在其它pH逆境反应相关基因中发现[6]。slr1501可能在更大范围的逆境适应中具有潜在作用，它的表达上调不仅只发生在pH值升高时，在高盐、黑暗、冷胁迫、热胁迫、缺铁、缺氮、缺磷等逆境条件，特别是强光下上调最显著[8]。但Taylor[7]的研究表明，在多重逆境（如高盐、高光和高渗透压）条件下，slr1501基因对集胞藻6803细胞生长具有负调控效应;在单逆境高pH条件下，缺失slr1501基因时，集胞藻6803细胞的生长不受影响。

目前，对集胞藻6803 slr1501的研究多停留在各种逆境条件下该基因的表达水平及抗逆反应上[3-7]，具体功能并未开展研究。基于此，本研究拟通过构建pET-28a（+）-slr1501表达载体，并在大肠杆菌中表达Slr1501蛋白，旨在为进一步研究该基因的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

集胞藻Synechocystis 6803基因组，本实验室提取保存;pET-28a（+）载体，本实验室保存;大肠杆菌DH5α和BL21 （DE3）感受态，购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2 主要试剂

DNA凝胶回收试剂盒、质粒回收试剂盒均购自OMEGA公司;限制性内切酶和T4 DNA连接酶均购自TaKaRa公司;PCR扩增高保真酶和PCR检测用酶均购自青岛擎科梓熙生物技术有限公司;his tag兔多克隆抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔二抗和ECL高灵敏度化学发光检测试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司。

1.3 slr1501基因克隆

根据Cyanobase中集胞藻6803基因组序列，应用Primer Premier 5.0设计扩增slr1501基因全长引物：slr1501-NdeⅠ-F：5′-ACTCCATATGGTGATGTCAACCACGCTAAA-3′和slr1501-XhoⅠ-R：5′-ACTCCTCGAGTTAGTTGAGACGCATACCAA-3′，上下游引物5′端分别引入NdeⅠ和XhoⅠ两个酶切位点（下划线处）。由青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成引物。

以集胞藻6803基因组DNA为模板，对slr1501基因进行扩增。PCR反应体系为50 μL：I5 PCR mix 25 μL，上下游引物各1 μL，DNA 1 μL，加ddH2O至50 μL。PCR反应程序：98℃ 2 min;98℃ 10 s，55℃ 10 s，72℃ 15 s，35個循环;72℃ 5 min。

1.4 pET-28a（+）-slr1501载体构建和转化

分别用NdeⅠ和XhoⅠ限制性内切酶双酶切slr1501目的基因和 pET-28a（+）质粒，后经1%琼脂糖凝胶电泳回收目的基因和pET-28a（+）线性片段。经T4 DNA连接酶16℃过夜连接后，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，Kan抗性筛选。挑取单克隆进行PCR和双酶切验证，并将阳性克隆送至青岛擎科梓熙生物技术有限公司进行测序。

将测序正确的pET-28a（+）-slr1501质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态，用Kan抗性进行筛选，挑取阳性克隆进行菌落PCR验证。

1.5 重组蛋白诱导表达

挑取含有重组质粒pET-28a（+）-slr1501的BL21（DE3）阳性菌落接种于5 mL含Kan抗性的LB液体培养基中，37℃振荡（180 r/min）过夜培养。取培养过夜的菌液按照1∶100的接种量接种至新的含Kan抗性的LB液体培养基上，37℃振荡培养2～3 h，至菌液OD600值达到0.6～0.8时，加IPTG（终浓度为1 mmol/L）开始诱导Slr1501蛋白表达，继续振荡培养，分别于诱导开始后0、2、4、6 h取 1 mL菌液离心收集菌体，加入100 μL的1% SDS，重悬菌体，70℃孵育10 min，后加入5×SDS蛋白上样缓冲液，混匀后于沸水中煮10 min，进行SDS-PAGE（12%分离胶，5%浓缩胶）电泳，90 V恒压至样品跑至分离胶内时，电压调至120 V，直至蛋白电泳结束。收集诱导6 h的pET-28a（+）-slr1501菌液3 mL，离心后加1 mL PBS悬浮菌体进行超声破碎，分别将上清和沉淀SDS-PAGE电泳，检测诱导的Slr1501重组蛋白可溶性。