花生抗黄曲霉相关基因PnLOX2的原核表达及RNAi载体的构建与转化

��+张廷婷+马登超+宫清轩+李春娟+闫彩霞+赵小波+单世华

摘要：本研究对利用基因芯片技术从抗、感黄曲霉花生品种中分离出的差异表达基因PnLOX2进行原核表达，得到分子量为121.5 kD的融合表达产物；构建了PnLOX2基因的3′端反向重复结构并转化花生，得到了转基因花生苗，为反向鉴定PnLOX2基因在花生抗黄曲霉侵染过程中的功能奠定基础。

关键词：花生；抗黄曲霉；原核表达；反向重复结构

中图分类号：S565.203.53文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）09-0001-06

花生是我国主要的油料作物和经济作物，在国家油脂安全和农产品国际贸易中占有举足轻重的地位。我国是世界生产花生最多的国家。花生易受黄曲霉感染，黄曲霉污染不仅直接危害人们的健康而且影响花生的品质和外贸出口，因此人们一直设法采取各种措施防止[1]。应用抗病品种是病害防治最直接有效的方法，但花生抗黄曲霉种质资源匮乏，加之常规育种周期长使得抗病品种远不能满足生产需求。随着生物技术的发展，运用基因工程手段将外源抗病基因导入花生为其抗病育种带来了新的希望[2]。

目前国内外已有不少关于花生抗黄曲霉基因克隆和鉴定的研究。Moyne等[3]从Bacillus subtilis AU195菌中分离出芽孢霉素，体外试验证明其对黄曲霉菌生长具有很强的抑制作用，目前该基因的分离克隆已经完成。还有研究认为，大豆脂肪酸氧化酶基因（LOX）对黄曲霉菌的侵染和产毒具有抗性作用[4]，但该观点尚需要进一步验证。核糖体失活蛋白（RIP）对抑制黄曲霉菌侵染和产毒也具有重要作用[5]。单世华等[6]分离克隆到花生种皮NBS结构域4个抗黄曲霉相关基因，如PnLOX2等，初步试验表明，这些基因在抗黄曲霉侵染过程中起到重要的抵御作用。

研究证明，发生于不同物种上的RNA沉默的直接引发因子都是双链RNA（dsRNA）[7～9]。dsRNA形成的一条有效途径就是将体外构建的反向重复（inverted repeats， IR）结构引入转基因植株。反向重复结构由两段IR DNA序列和一段spacer序列组成，两段IR DNA由spacer连接起来，转录后会形成发夹结构（hpRNA）。hpRNA由“茎”（stem，是IR DNA转录的产物配对形成的双链）和“环”（loop，是spacer DNA转录的单链结构）组成。其中，双链“茎”部分是诱发基因沉默的关键部位，“茎”的长短影响RNA沉默的效率和稳定性。研究发现植物中适当长度的dsRNA同源片段均能高效诱发转录后基因沉默（PTGS）[10]。李鹏等在前期研究中转化PVYN-CP基因5′端和3′端不同“茎”长度（环50 bp）hpDNA的烟草均获得了很高的抗病率[11～13]，并证明3′端序列的hpRNA沉默效率要高于5′端。

本研究构建了PnLOX2基因的原核表达载体，将该基因在大肠杆菌中进行表达，为下一步纯化蛋白并进行体外抑菌鉴定提供基础。同时以PnLOX2基因的cDNA为模板构建3′端（茎207 bp，环40 bp）的反向重复结构，并转化花生，以检测PnLOX2的反向重复结构对于转录后基因沉默的诱导效应，为反向鉴定PnLOX2基因在花生抗黄曲霉侵染过程中的功能奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1植物材料花生品种J11（高抗黄曲霉）、金花1012（高感黄曲霉）、花育22（中感黄曲霉）由山东省花生研究所提供。

1.1.2菌株和质粒载体载体pGEX-4T-1、pUC19、pROK Ⅱ和大肠杆菌BL21、农杆菌EHA105为本实验室保存。

1.1.3仪器与试剂试验用高速冷冻离心机由美国BECKMAN公司生产；紫外凝胶成像仪、琼脂糖凝胶电泳仪及配套电泳槽等由博日公司生产；垂直电泳装置及电泳仪为北京六一仪器厂产品；其它如电热恒温培养箱、超净工作台、恒温水浴锅、磁力搅拌器、涡旋混合仪、1/10000和1/10电子天平、754-UV紫外分光光度计、pH计、台式离心机、全温摇床等均为国产。

Tris、SDS（电泳级）、EDTA、DTT、TEMED购自Solarbio公司；溶菌酶、丙烯酰胺和N，N-亚甲双丙烯酰胺购自上海生工生物技术工程技术服务有限公司；Taq酶、内切酶、连接酶购自大连宝生物公司；其它常规试剂均为国产分析纯。

1.2试验方法

1.2.1原核表达载体的构建及转化质粒DNA提取方法参照天根公司质粒小提试剂盒说明书。PnLOX2基因产物与pGEX-4T-1载体用Sma Ⅰ和XhoⅠ分别双酶切，37℃酶切3 h，1%琼脂糖凝胶电泳检测后分别回收目的片段，T4 DNA Ligase、16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α。利用菌落PCR（引物P1：5′-ATGTTTTCAGGGGTAACCGG-3′，P2：5′-TTAGATAGAGATGCTGTTTG-3′）、酶切和测序方法对重组表达载体进行鉴定。

参照王关林《植物基因工程》[14]制备大肠杆菌BL21感受态细胞。将经测序鉴定正确的重组表达载体pGEX-4T-1-PnLOX2质粒DNA转化宿主菌BL21感受态细胞，以转化空载体pGEX-4T-1为对照。鉴定转化的正确性。

1.2.2目的基因诱导表达挑取鉴定为阳性的克隆菌和转空载体对照菌分别接种于含50 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、180 r/min振荡过夜培养。取上述培养物接种于新的含50 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，继续振荡培养，在2、3、4 h分别取样检测OD550值，至OD550=0.5～1.0时加IPTG至终浓度为1.0 mmol/L，30℃诱导表达2～3 h，取菌液，提取蛋白粗提物，进行SDS-PAGE电泳、染色及脱色，方法参照王关林《植物基因工程》[14]。

1.2.3PnLOX2 3′端反向重复结构的构建（1） PnLOX2 3′端反向重复（inverted repeat， IR） 结构引物的设计：根据本实验室已克隆的 PnLOX2 3′全长的cDNA序列（2 592 bp）设计合成引物（表1，下划线部分即酶切位点）。片段Ⅰ和片段Ⅱ连接后形成反向重复结构（IR），转录后形成hpRNA （图1）。

（2）PnLOX2 3′端反向重复结构的构建：以 PnLOX2 3′cDNA为模板，利用人工合成的2对PCR引物（表1）进行PCR扩增获得目的片段Ⅰ、Ⅱ，经纯化后分别用BamH Ⅰ酶切，回收酶切产物，将摩尔数大致相等的2个片段用T4 DNA Ligase、16℃反应过夜，片段Ⅰ和片段Ⅱ的连接产物用3′IR表示。对3′IR和pUC19质粒用XbaⅠ和KpnⅠ分别进行双酶切，连接得到重组载体pUC19-3′IR，并转化大肠杆菌DH5α。

1.2.4植物表达载体构建用Xba Ⅰ 和Kpn Ⅰ 双酶切重组克隆质粒pUC19-3′IR，回收3′IR，插入到双元表达载体pROK Ⅱ 的CaMV 35S启动子和胭脂碱合成酶基因（nos）终止子之间的Xba Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切位点，获得植物表达载体pROK-3′IR。

1.2.5花生转化和转化植株的检测利用冻融法将植物表达载体pROK-3′IR直接导入农杆菌EHA105，同时以转化pROK Ⅱ空质粒为对照。用侵染胚小叶法分别转化花育22、J11和金花1012，再生植株通过卡那霉素抗性筛选、PCR检测（引物P3：5′-TTCATTTGGAGAGAACACGG-3′，来自CaMV 35S启动子序列；P4：5′-GCGCGGATCCGAATCACACTTAGCTGTCT-3′。扩增片段约为350 bp）以及Southern-blot检测，获得转基因植株。

2结果与分析

2.1PnLOX2基因原核表达载体构建

对PnLOX2基因及pGEX-4T-1表达载体分别进行SmaⅠ和XhoⅠ双酶切，结果见图2和图3，分别获得2 500 bp的目的基因片段和4 900 bp的载体片段，酶切结果较好，可进行下一步连接试验。

将PnLOX2基因片段与pGEX-4T-1载体片段按摩尔比1∶3～1∶8混合，T4 DNA Ligase连接过夜，获得原核表达载体pGEX-4T-1-PnLOX2，转化大肠杆菌感受态细胞。

2.2pGEX-4T-1-PnLOX2重组载体鉴定

2.2.1菌落PCR鉴定挑取经蓝白斑筛选的白色菌落进行PCR扩增，由图4可以看出，转化大肠杆菌DH5α获得了5个阳性克隆。由图5可知，

2.2.2酶切鉴定pGEX-4T-1-PnLOX2单、双酶切鉴定结果如图6（1～3：DH5α，4～6：BL21）所示，双酶切均获得了2 500 bp的PnLOX2基因片段和4 900 bp的pGEX-4T-1载体片段。条带3、6为单酶切结果。单、双酶切结果表明目的基因片段已与载体连接并成功转化大肠杆菌DH5α和BL21。

2.2.3测序鉴定经测序分析，转化进大肠杆菌DH5α及BL21的PnLOX2基因与原序列的同源性分别为99%和98%，各编码863个氨基酸，无突变和移码，可以进行下一步的原核表达试验。

2.3PnLOX2基因的原核表达

如图7可以看出，与转化空载体对照相比，重组表达载体pGEX-4T-1-PnLOX2转化大肠杆菌BL21后，在121.5 kD处有明显条带。表明PnLOX2基因能在大肠杆菌中表达，这为下一步确定目的蛋白在体细胞中的分布及蛋白抑菌鉴定奠定了基础。

2.4PnLOX2 3′端反向重复结构及植物表达载体的构建

以PnLOX2的cDNA为模板，利用人工合成的2对PCR引物（表1）进行扩增。PCR产物经纯化、酶切（BamHⅠ）、连接处理后获得3′IR，3′IR再同时与pUC19质粒经双酶切（XbaⅠ和KpnⅠ）后连接并转化大肠杆菌DH5α，经酶切鉴定、PCR检测表明，3′IR已插入到pUC19中（图8）。

分别用XbaⅠ和KpnⅠ双酶切重组克隆载体pUC19-3′IR，切下目的基因3′IR，插入到植物双元表达载体pROKⅡ的位点XbaⅠ和KpnⅠ之间。酶切鉴定表明成功构建了植物表达载体pROK-3′IR。

2.5转基因植株的获得与筛选

将植物表达载体pROK-3′IR及空质粒pROKⅡ利用冻融法导入农杆菌EHA105。利用侵染幼胚小叶的方法将pROK-3′IR转化花生品种花育22、J11和金花1012，分别获得再生植株，如图9所示，转基因植株在含有卡那霉素的培养基上生长正常。

2.6转基因植株的PCR检测

以微量提取的转基因植株总DNA和非转基因植株花育22总DNA为模板，进行PCR检测，结果（图10）显示，非转基因植株无扩增条带，而转化植株（除编号为7外）均扩增出一条大小约为350 bp的条带，与预期大小相同，初步证明目的基因已经整合到花生的基因组中。

2.7转基因植株的Southern-blot检测

为了进一步证明目的基因已经整合到花生基因组中，大量提取转基因和非转基因花育22植株的总DNA，用限制性内切酶EcoR Ⅰ进行酶切，以目的基因PnLOX2的DNA片段为探针，进行Southern杂交分析。结果（图11）显示，阳性对照有1条杂交带，转基因植株有1～3条杂交带，非转基因植株没有杂交带，说明目的基因已经成功转入花生，并整合到花生基因组中，并且不同转基因植株中存在不同的拷贝数。

3结论与讨论

本研究构建了PnLOX2基因的原核表达载体，与GST融合后重组蛋白大小为121.5 kD，蛋白较大，较难于表达。通过分析PnLOX2基因重组蛋白表达量，推测PnLOX2基因所表达的蛋白应为一种抑菌蛋白。本试验为下一步纯化蛋白进行体外抑菌鉴定、利用基因工程手段解决花生黄曲霉污染提供基础。

dsRNA是诱发基因沉默的关键因子，人为设计的反向重复序列在转基因植物中形成dsRNA可以诱发高效的基因沉默[10]。研究表明，hpRNA中的“茎”部分是诱发基因沉默的关键部位，影响RNA沉默的效率和所形成的hpRNA的稳定性。目前的RNA沉默研究中，多以目的基因的5′端和3′端构建载体转化植物[11，12，15～23]，并以3′端效率更高[17～22]。因此，本研究构建PnLOX2基因的3′端反向重复结构用以转化不同类型的花生植株，并获得转基因后代，下一步将检测pROK-3′IR是否诱发PnLOX2基因沉默以及转基因植株的抗黄曲霉效果。

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