间充质干细胞治疗非酒精性脂肪性肝炎的机制及进展

唐振霆，施晓雷，2

（1.南京医科大学 鼓楼临床医学院，江苏 南京 210005；2.南京鼓楼医院 普外科，江苏 南京 210008）

1 非酒精性脂肪肝炎及治疗现状

非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）是一种除酒精外由其他各种因素导致的肝细胞内脂肪堆积和肝小叶内炎症为特征的临床病理综合征[1]，由非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver，NAFLD）进展而来，并可发展成肝硬化甚至肝癌。原发性NASH主要由肥胖、高脂血症、糖尿病、胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）和代谢综合征（metabolic syndrome）等因素损伤肝脏导致的病理学改变；继发性非酒精性脂肪肝则由病毒性肝炎、药物等因素引起。目前NASH的发病率呈上升趋势，在我国是仅次于病毒性肝炎的慢性肝病，对国民健康和社会发展构成威胁。NASH是一种多系统受累的多发性疾病，与糖尿病和代谢综合征相互影响。目前NASH的治疗方式仅为控制症状的改变不良的生活方式、药物治疗以及减肥手术，但这些手段都难以逆转NASH以及肝纤维化。

目前细胞移植治疗肥胖引起的代谢性疾病成为研究热点，其中间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）因其来源广、增殖快成为重点研究的干细胞。一项系统性的回顾性研究认为，间充质干细胞治疗肥胖相关的代谢性疾病很有前景[2]，而且多数研究认为MSCs通过抗炎、调节免疫功能等发挥治疗功能。因此，本文针对MSCs治疗NASH及其相关代谢性疾病的可能机制及MSCs的优化方案做一介绍。

2 MSCs治疗非酒精性脂肪性肝炎的机制

2.1 胰岛素增敏/胰岛功能

胰岛素抵抗与肝脏脂质聚积之间存在密切关联。胰岛素对肝脏糖异生和脂肪从头合成起着重要作用。胰岛素通过抑制肝脏糖异生维持血糖平衡，胰岛素抵抗的发生则失去了这一作用[3]，进一步促进胰腺分泌胰岛素以维持血糖水平。研究表明，胰岛素抵抗选择性涉及葡萄糖代谢途径，因此持续增加的胰岛素水平过度刺激脂肪从头合成，导致脂质生成增加[4]。Cao等[5]在使用MSCs治疗高脂饮食诱导的肥胖症引起的胰岛功能损害中发现，MSCs可以减少炎症因子肿瘤坏死因子α（TNF-α）、小鼠含生长因子样模体粘液样激素样受体（F4/80）的表达，恢复肝脏胰岛素受体（InsR）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）的表达，抑制胰腺炎症，进而保护胰岛β细胞群。因此MSCs通过影响胰岛素敏感性发挥保护作用可能是潜在的治疗机制。MSCs治疗1型糖尿病的临床研究发现，MSCs单次注射能保护和维持胰岛β细胞的残存功能[6]。另外，MSCs通过分化成胰岛素生成细胞缓解2型糖尿病[7]。还有研究发现，MSCs能够迁移到包括胰岛在内的损伤区域，降低胰岛细胞的凋亡[8-10]。Si等[9]发现，在使用MSCs治疗高脂饮食或链脲佐菌素（STZ）诱导的2型糖尿病中，MSCs能够提高周围靶组织的胰岛素敏感性，早期使用MSCs还能促进β细胞功能。在胰岛素抵抗的分子机制中，葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）从细胞内囊泡转运至细胞膜被认为是胰岛素信号转导的最后一步，GLUT4数量的减少和转运至细胞膜的减少与胰岛素抵抗有关[10]。MSCs可以恢复GLUT4数量并促进其迁移至细胞膜，改善胰岛素抵抗。综上，MSC在NASH中可能通过保护胰岛功能和改善胰岛素敏感性而发挥治疗作用（见图1）。

图1 MSCs治疗NASH及其代谢综合征的机制

2.2 调控脂质代谢

关于NASH的病理变化，“二重打击”是目前普遍接受的假说。“第一重打击”始于肝内游离脂肪酸的堆积导致肝脂肪变，使得肝脏更易遭受“第二重打击”，包括氧化应激、线粒体功能障碍和炎症，最终发展为肝硬化甚至肝癌[11]。

MSCs调节脂质代谢是其发挥保护肝功能的重要机制。动物实验表明，MSCs移植后肝脏脂质代谢的相关指标有所改善。Liao等[12]的研究表明，MSCs移植入NASH大鼠体内后，血清脂肪酸（FA）、总胆固醇（TG）和甘油三酯（TC）相对于平衡盐溶液治疗组出现下降。Ezquer等[13]发现，高脂喂养小鼠脂肪酸转位酶（FAT/CD36）和脂肪酸合成酶（FAS）水平显著增加，乙酰辅酶A氧化酶（ACO）和细胞色素酶CYP2E1水平减少，而经过MSCs治疗的肥胖小鼠肝脏内脂肪酸氧化相关酶没有被损坏，原因是通过改变主要代谢组织中过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）亚群的表达降低了肝脏的脂质堆积[14]。脂肪和骨骼肌中PPARα和PPARγ与β氧化和脂肪酸摄取有关，进而减少脂肪酸转运至肝脏[15-16]。Winkler等[17]在MSCs治疗NASH的研究中发现，低水平的微粒体甘油三酯转运蛋白并没有得到纠正，推测肝脏TC可以为MSCs介导的肝再生提供主要能量来源。有研究也证实了微小的脂肪变性可以促进部分肝脏切除后的肝再生[18]。因此，MSCs可以通过调节脂质代谢使肝脏功能得到改善。

2.3 调控糖代谢

既往大多数对MSCs治疗脂肪肝的机制研究主要集中在胰岛素敏感性和脂质代谢，目前已有研究显示MSCs也参与调控葡萄糖代谢。Xie等[19]在使用MSCs治疗2型糖尿病的研究中发现，MSCs可以刺激肝脏腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）途径磷酸化，调节葡萄糖代谢，降低血糖浓度，进而恢复2型糖尿病的肝糖代谢。糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）[20]是普遍存在于哺乳动物真核细胞中的丝氨酸/苏氨酸激酶，参与肝糖的合成代谢，通过抑制糖原合成酶的活性降低肝糖合成，升高血糖浓度，是肝糖代谢的关键酶。Park等[21]发现，在使用MSCs分泌的细胞外囊泡治疗缺血再灌注导致的心肌损伤中，MSCs通过分泌的细胞外囊泡中miRNA-26a减少了GSK3β的表达，缓解了缺血再灌注损伤，从而起到保护作用。Ding等[22]在MSCs治疗肝功能衰竭的研究中发现，MSCs通过抑制GSK3β促进糖原合成从而提高90%部分肝切除术后大鼠的存活率。然而目前MSCs调控糖代谢中关键酶的机制研究尚不多，可能成为未来研究的热点。

2.4 旁分泌作用

目前研究普遍认为分泌可溶性因子是MSCs发挥疗效的主要机制之一。持续并过量的脂质堆积造成的脂毒性会诱导肝细胞凋亡。MSCs分泌的细胞因子（IL-6）在肝再生过程中可以上调抗凋亡因子（Bcl-2、Bcl-xL）的表达，抑制肝细胞凋亡[23]。同时，MSCs能够分泌前列腺素E，促进肝细胞增殖[24]。此外，MSCs分泌的细胞因子（VEGF、bFGF、HGF、EGF）对肝细胞有促进血管形成的作用，促进肝脏再生[25-26]。除了抗凋亡作用，MSCs旁分泌还有抑制炎症的作用，细胞外囊泡包括微泡和外泌体在细胞抗炎修复中起到重要作用。Liu等[27]发现，MSCs分泌的外泌体可以抑制巨噬细胞内炎症小体（NLRP3）的激活，进而对肝脏炎症起到缓解作用。此外，MSCs来源的外泌体通过缓解氧化应激减轻肝脏缺血再灌注损伤[28]。MSCs的培养上清中可以检测到超过150种蛋白质，其中大部分是生长因子和细胞因子[29]，针对MSC旁分泌因子的作用机制仍值得深入探究。

2.5 抗纤维化

NAFLD是世界上最常见的慢性肝病之一[30]。肝纤维化的出现是决定预后的重要因素，而进展至NASH的患者有20%会发展成晚期肝纤维化[31]。因此，缓解肝脏纤维化进程是MSCs治疗NASH的潜在方向之一。

MSCs能缓解肝纤维化的作用主要与抑制肝星状细胞的增殖和活化有关[32]。研究发现，使用MSCs治疗NASH后，IV型胶原蛋白表达减少，致纤维因子TGF-β1下调并且α-SMA+星状细胞减少[13，33]。Ezquer等[34]发现，在使用MSCs治疗脂肪肝肝切除导致的损伤中，原先表达α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、结蛋白（desmin）和波形蛋白（vimentin）的MSCs一旦注入体内后就改变了表型，表现为仅表达促增殖标志物结蛋白和波形蛋白。Huang等[35]在使用MSC治疗TAA诱导的爆发性肝功能衰竭中发现，MSCs通过下调巨噬细胞浸润和促进肝星状细胞凋亡或减少激活肝星状细胞来缓解肝脏纤维化。此外，MSCs可以通过表达MMP-9降解细胞外基质[36-37]。有研究发现，MSC通过转换成纤维性疤痕成肌纤维细胞（fibrous scar-produced myo fibroblasts）加快纤维化的进展，另有一些研究则认为MSCs对肝纤维化没有作用[38-39]。因此，MSCs对于肝纤维化的调控还值得进一步研究。

2.6 抗炎和免疫调节

炎症细胞在NAFLD进展至NASH甚至肝细胞性肝癌的过程中发挥着重要作用[40]。Kupffer细胞、单核细胞、树突细胞、NK细胞和T细胞可以通过分泌细胞因子启动肝脏炎症反应[41]。MSCs可通过前列腺素E2途径抑制Kupffer细胞中炎症小体的激活[42]，并且可促使Kupffer细胞由促炎型（M1）向抗炎型（M2）转化，从而减少TNF-α和IL-6的表达，提高IL-4和IL-10的表达水平[43]。另外，MSCs可以调节自然杀伤T细胞（NKT cells）和调节性自然杀伤T细胞（NKTregs）的比例来缓解肝脏损伤[44]。Wang等[45]发现，MSCs可以抑制高脂饮食导致的CD4+T细胞的增殖，进而缓解脂肪变和炎症，缓解高脂饮食诱导的NAFLD。MSCs可以调节肝纤维化相关因子，减少IL-17以及产生IL-17的Th17细胞，提高IL-10的表达。此外，MSCs上清还能促进分泌IL-10的调节性T细胞细胞增殖并抑制Th17细胞增殖[46]。MSCs对自然杀伤细胞（NK cells）也具有调节作用，研究表明MSCs通过诱导调节衰老样NK细胞表型终止炎症反应，并且NK细胞的反馈也会促进MSCs增殖和促血管生成特性[47]。因此，MSCs可能通过对免疫系统的调节发挥对NASH的治疗作用。

3 MSC移植的问题与优化方案

另一方面，MSCs移植的副作用及安全性也值得重视。MSCs寿命较长，抗凋亡能力及复制更新能力有着和肿瘤细胞类似的特点，因而对其临床应用有着致瘤性的顾虑。Centeno等[48]对227例患者使用培养扩增的自体来源MSCs治疗骨科疾病，长期检测未发现有肿瘤形成。有研究将脐带来源的MSCs移植到小鼠皮下后两个月未观察到肿瘤形成[49]。但Miura等[50]研究发现，小鼠BMSCs染色体存在不稳定性，可能导致恶性转化。尽管体内和体外实验没有发现MSCs的致瘤现象，但是仍需要进一步探究MSCs培养过程中突变的可能性，完善对MSCs的功能评估。

发热是MSCs移植后常见的不良反应[51-52]。因MSCs具有低免疫原性，MSC移植引起的发热与免疫反应无明显直接关系，移植患者无需特别治疗可以自然恢复。

虽然MSCs的基础研究和临床研究日益增多，但是MSCs的治疗效果仍然有待提高。近年来，随着组织工程学研究的不断深入，利用材料模拟MSCs培养微环境取得了新的进展[53]。传统的二维培养系统较为简单，但是可能导致MSCs的生物组织结构和生物信息丢失，影响MSCs的生物功能。三维支架的研究为MSCs的培养提供了新的思路，将干细胞黏附在具有良好生物相容性、可降解性和可吸收的生物材料使其良好生存并长期发挥功能。常用的三维细胞培养支架材料分为脱细胞支架、天然生物材料支架和合成材料支架[54]。脱细胞支架由于保留了组织的结构是理想的支架之一，但由于天然组织结构复杂难以确保制备过程中质量的稳定性[55]。天然生物材料来源于动物或人体，因其低抗原性、可降解受到研究者的关注，其中胶原凝胶可以使营养物自由进出，利于细胞黏附和增殖，是一种有前景的生物材料。Murphy等[56]发现，通过改变纤维蛋白水凝胶的特性可以促进MSCs分泌VEGF和PGE2，从而促进伤口愈合。合成材料支架主要有可控性、可塑性等优点，主要有聚乳酸、聚乙醇酸、聚己内酯和聚碳酸酯等，但是人工合成材料也有亲水性差、细胞黏附性较弱的缺点。因此生物材料对MSCs培养的优化还需要更多的研究。

4 总结与展望

虽然近几年MSCs在治疗多种疾病的研究中显示了众多优势，但将其广泛运用于临床还需要进一步深入研究。MSCs移植还有一些问题需要解决，如MSCs移植的合适时机、注射剂量及优化培养方案。如何提高MSCs在体内的存活率、定植率和安全性并发挥治疗作用尚未明确。但MSCs在胰岛素抵抗、糖脂代谢紊乱、肝纤维化以及炎症免疫等方面的调节作用为进一步研究MSCs移植治疗NASH提供了希望。