GPRC5A在胰腺癌中的mRNA表达情况及其对糖酵解能力的影响

蒋永升，沈洋，杨敏威，陶泠烨，何睿哲，孙勇伟

（上海交通大学医学院附属仁济医院 胆胰外科，上海 200127）

据相关报道，在其他肿瘤预后显著提高的背景下，从1971年至2011年这四十年间胰腺癌患者的预后却几乎没有任何改善[1-4]。多种生物学特征造成了这一结果，有氧糖酵解在其中最为突出。相较于氧化磷酸化过程，肿瘤更倾向于利用糖酵解的方式获取能量，即有氧糖酵解[5]，也被称为瓦伯格效应（Warburg effect）[6]。根据Bailey、Collisson基于表达谱水平提出的胰腺癌分型标准[7]，预后最差的准间质亚组（quasimesenchymal subtype）也表现出显著增强的糖酵解活动[8]。因此，近年来大量的研究聚焦于细胞糖酵解对胰腺癌发生发展的作用，认为肿瘤细胞糖酵解处于癌症发生发展的关键环节，也指出针对肿瘤细胞糖代谢异常的治疗方法可能是胰腺癌治疗的关键[9-12]。

本研究中，我们旨在寻找影响胰腺癌有氧糖酵解的新分子机制，增加对胰腺癌的认识与了解，进而发现潜在的治疗靶点。G蛋白偶联受体（G-proteincoupled receptors，GPCRs）是人体内最大的跨膜受体家族，在细胞信号传递中发挥着重要的作用[13]。近年来针对G蛋白偶联受体C型家族5A基因（GPRC5A）的研究发现，其对肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭等细胞功能均存在影响，并且在结肠癌、乳腺癌、胃癌等多种恶性肿瘤中均存在异常高表达[14]，但针对其在胰腺癌中的研究却鲜有报道，因而本研究拟分析GPRC5A在胰腺癌临床样本中的表达情况及其对胰腺癌细胞有氧糖酵解的影响。

1 材料和方法

1.1 表达谱芯片组织样本

本课题中所用建立表达谱芯片的原始样本为50对上海交通大学医学院附属仁济医院胆胰外科2012年1月至2013年12月期间手术治疗并通过术后病理确诊的胰腺癌患者的胰腺癌组织与癌旁组织。本表达谱芯片所有患者组织及临床资料的收集与使用均通过上海交通大学附属仁济医院伦理审查委员会的审核与批准。

1.2 生物信息学分析资料

本课题所用的TCGA数据库中的胰腺导管腺癌的mRNA测序数据下载自TCGA数据库，GTEx正常胰腺mRNA测序数据下载自GTEx数据库，GSE16515和GSE28735的mRNA数据下载于GEO数据库。基因富集分析结果通过GSEA软件分析Hallmarks数据集所得。

1.3 胰腺癌细胞系的复苏培养与干扰GPRC5A表达

本研究所用细胞均购自上海中科院，在含有10% FBS（美国Gibco公司）和双抗的1640培养基（上海源培生物科技有限公司）或DMEM培养基（上海源培生物科技有限公司）中培养，孵育箱设置条件为37 ℃、5% CO2。

进行小干扰RNA（siRNA）转染前，将对数生长期胰腺癌细胞转入6孔板培养，每孔细胞生长至60%左右，换液，将siRNA（上海吉玛制药技术有限公司）与Lipofectamine 2000（赛默飞公司）混匀加入配液中，6～8 h后换液，转染48 h后检测干扰效率。干扰序列：siGPRC5A-1：5’-AGGCAGCAUUUUUCGCC UGTT-3’；siGPRC5A-2：5’-GCTTATGTTAGTCCCG AGTTT-3'。

1.4 细胞总RNA提取、逆转录、Real-time PCR检测

步骤参考文献[15]。

1.5 Seahorse糖酵解能力测定

为测定细胞的代谢方式与代谢强度，我们利用XF 96 Seahorse分析仪检测细胞的细胞外酸化程度（ECAR），以5 000～20 000/孔的密度将细胞种到XF96孔板中，在37 ℃培养箱中孵育过夜，使细胞贴壁，为测定ECAR值，顺次向培养皿中加入葡萄糖、寡霉素和2-DG，待机器读数完成后分析数据结果。详细操作过程参考文献[15]。

1.6 统计学分析

利用SPSS 20.0软件进行统计学分析，组间比较使用t检验或者卡方分析，Kaplan-Meier法进行预后分析。P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 GPRC5A的筛选过程

为了筛选出胰腺癌中与糖酵解相关性高的癌基因，我们设定筛选条件：（1）在课题组50对表达谱芯片（仁济表达谱芯片）中癌与癌旁组织具有统计学差异性表达（P＜1×10-5）；（2）在仁济表达谱芯片数据中与糖酵解相关基因的相关性排名前10%；（3）在The Cancer Genome Atlas（TCGA）胰腺癌数据库中与糖酵解相关基因的相关性排名前10%；（4）属于Collisson的胰腺癌分型中预后最差的一组——准间质亚组（quasimesenchymal subtype）的标志性基因[7]。经过筛选，我们最终得到包括GPRC5A在内的七个基因（GPRC5A、HMMR、SLC5A3、SLC16A1、TWIST1、PMAIP1、NT5E），其中并未发现关于GPRC5A在胰腺癌有氧糖酵解影响的报道，因此，本研究中我们选取GPRC5A做进一步的研究与机制探讨（图1A）。

2.2 GPRC5A在临床数据库中的表达情况

我们首先从Gene Expression Omnibus（GEO）公共数据库中下载了GSE15471、GSE16515、GSE28735三个公共数据集并结合课题组50对表达谱芯片数据，并分别在三个数据库中比较了肿瘤与癌旁组织中GPRC5A的表达情况，结果发现，GPRC5AmRNA在肿瘤组织中的表达水平均高于癌旁组织（GSE15471，P＜0.0001；GSE16515，P=0.0157；GSE28735，P＜0.0001） （图1B）。我们接着比较了GPRC5A在TCGA的肿瘤样本与The Genotype-Tissue Expression（GTEx）中的正常样本中的表达情况，结果同样显示GPRC5A在肿瘤样本中表达量更高（图1C） （P=0.0311），为判断GPRC5A表达量对胰腺癌预后的影响，我们将179例TCGA胰腺癌标本根据GPRC5A表达量高低分为两组，并对两组患者的预后进行了比较，结果显示高表达GPRC5A的患者无论是总生存期（P=0.0069）还是无进展生存期（P=0.02）均显著短于GPRC5A低表达组（图1D），以上结果提示我们GPRC5A在胰腺癌中高表达，其高表达预示着患者具有较差的预后。

2.3 GPRC5A促进胰腺癌细胞的糖酵解

图1 糖酵解相关基因筛选及GPRC5A的表达与预后分析

由于GPRC5A是通过根据与糖酵解相关基因的相关性筛选得到的，我们推测其是否通过影响胰腺癌细胞的糖酵解能力进而发挥了促进肿瘤生长的作用。首先，我们把测序得到的50对表达谱芯片数据根据GPRC5A的表达情况分为高、低表达两组，并进行了基因富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA），结果提示糖酵解数据集在GPRC5A高表达组中存在富集（图2A）。另外我们还分析了表达谱芯片中GPRC5A同糖酵解关键酶的相关性，发现其与绝大部分的关键酶均存在较高的正相关性（图2B）。我们接下来测定了不同胰腺癌细胞系中GPRC5A的表达情况，并选择其中表达量较高的AsPC-1和BxPC-3进行后续的细胞功能实验（图2C），通过siRNA在两个细胞系中对GPRC5A的表达进行干扰并通过实时定量PCR进行效率验证（图2D）。随后，我们通过Seahorse检测仪检测了正常与GPRC5A干扰的细胞中细胞外酸化程度（ECAR），结果显示两个细胞系中GPRC5A敲低组的ECAR值均显著低于对照组（图2E），提示干扰GPRC5A后肿瘤细胞的糖酵解能力出现减弱。

图2 GPRC5A对胰腺癌细胞糖酵解能力的影响

3 讨论

糖酵解作为肿瘤的重要特征之一，在胰腺癌中具有更为重要的意义，原因在于胰腺癌的一个重要特征是其具有丰富的细胞外基质成分，这导致肿瘤组织内乏氧、乏血供的肿瘤微环境，在这种条件下肿瘤更加依赖不耗氧的糖酵解获取能量[16]。通过糖酵解细胞能更快地获取能量，满足其对能量的快速需求。另外，肿瘤细胞增殖复制需要大量的核苷酸、氨基酸等生物大分子及前体物质，而糖酵解产生的中间产物则能很好地对其合成代谢进行原料的补充，这也是器官发育过程中干细胞的主要代谢特点。

在本研究中，我们首先通过数据分析发现了GPRC5A可能对胰腺癌糖酵解过程存在促进作用，一方面，我们利用TCGA、GEO等数据库证实GPRC5A在胰腺癌组织中表达量显著高于癌旁组织，同时其高表达预示着较差的预后，另外我们也通过GSEA数据分析、Seahorse糖酵解实验证实了我们的猜想。

G蛋白偶联受体C型家族5A（GPRC5A）属于人体内最大的蛋白超家族G蛋白偶联受体，包含有超过700个基因，这一家族在多种生物学过程中均发挥了重要的功能，也经常被利用为药物作用靶点。G蛋白偶联受体在肿瘤进展中也发挥了不可或缺的作用，因此进一步研究这一家族在胰腺癌中的作用具有重要意义，GPRC5A基因在在多种肿瘤中均有报道，但其发挥的功能不尽相同，在乳腺癌中GPRC5A高表达可以促进肿瘤细胞的增殖[17]，而在肺腺癌中GPRC5A则被认为是抑癌基因，在GPRC5A敲除的小鼠中有76%的小鼠出现了肺腺瘤，17%的小鼠出现了肺腺癌[18]。

综上所述，在本次研究中我们揭示了GPRC5A在胰腺癌中对糖酵解的促进作用，存在着作为治疗靶点的潜力，但其发挥功能的具体机制还有待进一步阐明。