伯氏疟内质网塑形蛋白SEY1敲除质粒的构建及转染

刘 影 ，史小雨 ，王 倩

（1.天津医科大学基础医学院免疫学系，天津300070）

疟疾（Malaria）是由疟原虫（Plasmodium）引起的，以按蚊为主要传播媒介的全球性寄生虫病，以非洲地区的发病率和死亡率最高。我国的疟疾传染由于灭蚊等努力一度绝迹，但近年来在南方一些省份已显死灰复燃之势，且面临着严重耐药问题[1-3]。目前疟疾相关研究过多的集中在疫苗和药物研发，却忽略了对疟原虫生物学机理的探索。

疟原虫作为一种真核生物，其致病性及宿主的免疫应答都与疟原虫的蛋白质分泌密切相关。疟原虫分泌的蛋白不仅嵌入自身质膜，还会进入纳虫泡腔以及宿主细胞的胞浆，甚至还会嵌入宿主细胞的质膜中[4-5]，在细胞黏附、免疫隔离、信号传递等多个过程发挥重要作用[6-7]，以创造更利于自身生长发育的环境。因此，研究疟原虫蛋白质分泌过程，特别是与蛋白分泌密切相关的细胞器—内质网（endoplasmic reticulum，ER），对探究疟原虫的致病机制尤为重要。

内质网是真核生物中最大的膜包被细胞器，由不间断的片状和管状结构组成。内质网参与多种重要细胞活动，均与其形态特征密切相关，特别是蛋白质分泌功能[8]。多个整合膜蛋白家族成员已被发现参与内质网形态的维持，如DP1、Atlastin和RTN等。笔者在前期研究中发现，真核细胞的内质网塑形蛋白（ER-shaping protein）Atlastin，属于 dynamin超家族的GTP酶，主要通过介导同源膜融合来构建内质网管状网络[9-10]，其缺失会减少COP II囊泡的形成，从而影响内质网中合成加工蛋白的运输[11]，说明内质网正常形态的维持与蛋白质分泌功能密切相关。此前已有研究尝试观察红外期和红内期疟原虫内质网形态[12]，但疟原虫内质网的具体功能及其在疟原虫致病性方面的作用目前尚无研究。通过疟原虫基因组分析，笔者在伯氏疟原虫（Plasmodium berghei,P.berghei）中找到哺乳动物Atlastin蛋白的同源蛋白PbSEY1（P.bergheiSEY1）。SEY1 在其他细胞内质网形态和功能维持中很重要，然而，笔者目前并不了解它如何在疟原虫中发挥功能，以及这些功能与蛋白质分泌及疟原虫致病性之间的关系。

为了探究伯式疟原虫内质网塑形蛋白PbSEY1在疟原虫寄生及致病过程中的作用，本研究利用敲除-回复载体pL0034，构建pL0034-△PbSey1重组质粒，结合疟原虫转染技术，基于单交换（single crossover）的同源重组（homologous recombination）原理，将PbSey1从疟原虫基因组中敲除，构建PbSey1缺失的疟原虫突变体，且在后续回复实验中，该突变体在药物作用下可直接恢复PbSey1的表达，为探究内质网塑形蛋白PbSey1在疟原虫致病性方面的作用提供了有力的工具。

1 材料与方法

1.1 实验材料 伯氏疟原虫P.bergheiANKA由罗格斯大学新泽西医学院Purnima Bhanot教授赠予，大肠杆菌载体pL0034于本实验室保存（图1），克隆感受态细胞Mach1-T1购自北京博迈德基因技术有限公司，质粒提取试剂盒购自QIAGEN公司，质粒小量抽提试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒均购自TransGen Biotech公司，限制性核酸内切酶EcoRV、NotI、KpnI及T4 DNA连接酶购自ThermoFisher公司，乙胺嘧啶购自Sigma公司，细胞核转染试剂盒购自Lonza公司。

图1 pL0034质粒图谱Fig 1 Plasmid profile of pL0034

1.2 实验方法

1.2.1 目的基因片段Segment I和Segment II的获取 以野生型伯氏疟原虫PbSey1基因的编码区（1-2742bp）为模板，分别扩增两个片段Segment I（S I，26-1059bp）和 Segment II（S II,1050-1958bp），并在两个片段上下游分别引入KpnI、EcoRV和KpnI、NotI酶切位点（PCR引物见表1）。PCR条件为：94℃预变性 30 s，以 98 ℃ 10 s，58 ℃ 1 min，68 ℃ 1 min，循环35次，68°C 5 min，4°C终止反应。琼脂糖凝胶电泳确定PCR产物片段大小正确后切胶回收，再将片段S II经KpnI、NotI酶切，酶切产物纯化后备用。

表1 目的片段PCR扩增引物Tab 1 PCR primers

1.2.2 重组质粒pL0034-△PbSey1的构建 先将片段S II通过酶切位点KpnI和NotI与pL0034在T4 DNA连接酶的催化下16℃连接过夜，次日将连接产物转化至感受态细胞Mach1-T1中，在含有氨苄的固体培养基上37°C倒置培养12 h，挑取阳性单克隆后摇菌扩增提取质粒。酶切鉴定及DNA测序确认片段S II插入无误后，利用In-Fusion无缝克隆的方法将片段S I与KpnI和EcoRV双酶切后的质粒 pL0034-S II连接（条件为 50°C，30 min），将连接产物转化至感受态细胞后进行氨苄筛选培养，挑取单克隆进行扩增并提取质粒，酶切鉴定及DNA测序确认片段S I插入正确。

1.2.3 疟原虫转染 将液氮中冻存的伯氏疟原虫感染血液通过尾静脉注射感染Wistar大鼠。每日鼠尾取血制备薄血片，Giemsa染色，油镜观察并计算虫血率。待虫血率升至3%～5%时，心脏取血收集大鼠血液，加入10 mL完全培养基，离心（200 g，8 min），弃去上清后将全部血细胞沉淀转移至150 mL完全培养基中，充入 5%CO2、5%O2、90%N2混合气体，于 500 mL 密封锥形瓶中，37°C、77～80 r/min条件下培养16～23 h。次日制备血涂片检查培养状况，若80%左右疟原虫发育为成熟裂殖体即可进行分离纯化。将培养液体分至4个50 mL离心管中，每管35mL，在底部缓慢加入10 mL Nycodenz/PBS溶液（密度梯度溶液），使二者产生明显界面，离心（200 g，25 min）。离心后在培养基与密度梯度离心液之间形成一个棕色液体薄层，即为裂殖体细胞层，用吸管小心将该层吸出，完全培养基洗涤1次，弃净上清后置于冰上备用。将 100 μL Nucleofector溶液、10 μg 重组质粒及30 μL分离得到的裂殖体混合电击后，尾静脉注入BALB/c小鼠，再经乙胺嘧啶筛选获得成功转染的疟原虫。

2 结果

2.1 疟原虫PbSey1基因敲除及回复策略 以野生型伯氏疟原虫Sey1基因编码区为模板构建的质粒pL0034-△PbSey1，转染后首先进行第一次同源重组（图2A），发生重组的同源臂为Segment II，使Sey1因片段缺失及无启动子而无法表达，即只有发生Segment II重组的疟原虫才能产生△Sey1的基因型，同时表达抗药标签hDHFR（human dihydrofolate reductase），可在乙胺嘧啶（pyrimethamine）筛选中存活，最终经单克隆筛选即可得到敲除Sey1的疟原虫。

获得PbSey1缺失疟原虫突变体后即可观察其表型并进行相关功能实验。为了满足后续回复实验的需求，本文所使用的基因敲除策略在进行回复实验时无需重新构建回复质粒，只需在药物筛选作用下发生第二次单交换的同源重组即可得到PbSey1回补的野生基因型。在5-氟胞嘧啶的作用下，Pb-△Sey1将进行第二次同源重组（图2B），同源臂为Segment I，重组可导致耐药标签hDHFR-yFCU的丢失而PbSey1重新表达。未发生第二次重组的疟原虫因含有标签yFCU（yeast enzyme cytosine deaminase and uridyl phosphoribosyl transferase），可将5-氟胞嘧啶转化为有毒性的5-氟尿嘧啶而被杀死，由此即可得到PbSey1回补的野生型疟原虫。

图2 疟原虫PbSey1基因敲除及回复策略Fig 2 PbSey1 knockout and rescue strategy in Plasmodium

2.2 重组质粒pL0034-△PbSey1的构建和鉴定 由于酶切位点设计的不同，首先扩增和插入的片段是Segment II（909bp）（图3A）。在其5′端第10位碱基引入一个点突变（T＞C）（图3C），在不影响其氨基酸编码的前提下产生酶切位点EcoRV（GATATC），同时在EcoRV（绿色箭头显示）的上游引入酶切位点KpnI（蓝色箭头显示）；在Segment II的3′端引入酶切位点NotI（红色箭头显示）（图3C）。利用KpnI和NotI两个酶切位点插入S II即可得到质粒pL0034-S II，酶切鉴定及DNA测序证明插入片段正确（图3A）。

pL0034-S II构建成功后，扩增、插入片段Segment I（1034 bp）（图3B）。在S I的5′端引入酶切位点KpnI（蓝色箭头显示），与S II相同，在3′端的末位碱基引入点突变（T＞C）而产生酶切位点EcoRV（绿色箭头显示）（图3C）。利用In-Fusion无缝克隆方法将S I插入质粒pL0034-S II，即得到质粒pL0034-△PbSey1，KpnI和NotI酶切鉴定及 DNA测序证明插入片段正确（图3B）。最后经EcoRV酶切将质粒线性化后即可用于疟原虫转染。

图3 重组质粒pL0034-△PbSey1的构建和鉴定Fig 3 Construction and identification of recombinant plasmid pL0034-△PbSey1

2.3 疟原虫转染及重组子的鉴定 伯氏疟原虫经同步化培养后约80%的疟原虫均已发育为成熟裂殖体，在此阶段进行转染效率最高。经电转后的疟原虫在小鼠体内生长，每日监测血涂片，100倍油镜下观察100个视野，若观察到疟原虫即为阳性，未找到则为阴性。转染后次日即出现疟原虫阳性，于小鼠饮水中加入乙胺嘧啶，给药2 d后血涂片疟原虫转为阴性，遂撤药。停药后第5天疟原虫再次转为阳性，至停药后第9天虫血率长至5%，心脏取血纯化疟原虫，提取基因组DNA，PCR鉴定及PCR产物DNA测序结果提示成功获得PbSey1缺失疟原虫突变体，但为混合克隆，PCR条带灰度分析显示PbSey1缺失疟原虫突变体约占50%（表2，图4）。

表2 PCR鉴定PbSey1敲除疟原虫引物Tab 2 PCR identification primers of PbSey1-deleted parasites

图4 疟原虫转染后重组子的鉴定Fig 4 PCR identification of PbSey1-deleted Plasmodium integrants

3 讨论

内质网作为真核细胞蛋白质合成、脂质合成和钙储存的关键细胞器，其结构和功能对真核生物的生存和繁殖极为重要，对于疟原虫也是如此。内质网塑形蛋白SEY1通过介导内质网同源膜融合参与管状网络结构的形成，若SEY1缺失将会对内质网的形态和功能以及细胞的生长发育造成影响。在哺乳动物中，Atlastin GTP酶（同源蛋白SEY1）的缺失会影响COP II包被囊泡的出芽生长，从而对内质网合成蛋白的运输产生负作用；人体内Atlastin（ATL）的缺失会造成遗传性痉挛性截瘫（hereditary spastic paraplegia，HSP）[13]；在拟南芥植物，其同源蛋白RHD3（root hair defective 3）的缺失则会影响生长素水平及生长素运输机制稳态，从而引起植物矮小，根毛变短和卷曲[14]；在果蝇中，ATL缺失会导致其神经元缺陷[15]；在白色念珠菌中，内质网的膜融合延迟甚至片段化则会使其毒力和致病力降低[16]。这些研究结果都为笔者研究PbSEY1在疟原虫内质网中的作用提供了依据和方向，促使笔者继续探究内质网塑形蛋白PbSEY1在疟原虫生长和致病过程中的作用。

在疟原虫中进行某种蛋白功能研究时，除了敲除该种蛋白外，对敲除株进行蛋白回补也是必不可少的实验步骤。在本研究中，笔者利用基因同源重组原理及质粒pL0034上药物筛选标签hDHFR和yFCU，将基因敲除和基因回复两个截然相反的实验目的融合在一个重组质粒中，避免了后期因回复实验而重复构建质粒及再次进行疟原虫转染[17]。此外，该质粒在进行PbSEY1的基因回复时是在疟原虫基因组中PbSEY1的原位进行回复，其表达量仍与野生型疟原虫一致，对基因组的其他序列也不会产生影响，确保了回复后疟原虫基因组的完整性和准确性。

通过疟原虫同步化培养和转染技术成功在伯氏疟原虫中敲除PbSEY1，获得了PbSEY1缺失疟原虫与野生型疟原虫的混合克隆。这是由于在乙胺嘧啶药物筛选过程中少量未发生同源重组的野生型疟原虫自发突变，获得耐药性而存活下来。对于混合克隆，常规应进行单克隆筛选，但笔者在进行单克隆筛选时却遇到了重重困难。笔者常规采用稀释法进行单克隆筛选，即每只小鼠仅尾静脉注射1个疟原虫，经多次尝试却始终无法得到PbSEY1缺失的单克隆虫株。据此，推测PbSEY1与其他物种中的同源蛋白有所不同，可能在疟原虫血液阶段的生长发育过程中发挥着至关重要的作用，以至于PbSEY1敲除虫株无法单独存活，其在疟原虫致病性方面的具体作用机制还有待于结合其它分子工具进一步深入研究。

综上所述，内质网膜塑形蛋白SEY1及其同源蛋白在细胞内有着不可或缺的作用，笔者推测在疟原虫体内更是如此。本研究成功构建了PbSEY1敲除-回复重组质粒pL0034-△PbSey1，建立了稳定的疟原虫转染平台，为后续深入研究SEY1蛋白在疟原虫中的具体功能提供了有利工具。