网络药理学探究神效瓜蒌散治疗乳腺癌作用机制

付精精，吴雄志

（天津医科大学肿瘤医院中西医结合科，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市“肿瘤防治”重点实验室，天津市恶性肿瘤临床医学研究中心，天津300060）

乳腺癌是世界范围内确诊率最高的癌症，每年新增病例167万例，死亡人数超过50万[1]，据报道，乳腺癌是女性癌症死亡的主要原因[2]，中国女性新诊断的癌症中有15%是乳腺癌[3]，其中75%的乳腺癌是雌激素ER阳性[4]。中医是我国的传统医学，中草药常用来治疗不同类型癌症，不仅可以减轻癌症疼痛、呕吐、腹泻、疲乏、白细胞减少等化疗副作用，还有抗增殖、抗迁移等作用，可以提高患者生存率[5-7]。神效瓜蒌散是传统的中药方剂，来源自宋·陈自明的妇科著作《妇人良方》，由瓜蒌、甘草、当归、乳香、没药组成，主治乳痈及一切痈疽初起，其中“乳痈”为古代文献常见的类似乳腺癌表现疾病，故选取神效瓜蒌散研究其抗乳腺癌的作用机制。网络药理学是基于生物分子网络构建“药物-靶点-通路”多层次网络分析药效活性成分和可能的分子网络机制,旨在建立中药及其复方多成分、多途径、多靶点间的协同作用联系[8-10]。本文将进行体外实验验证神效瓜蒌散对乳腺癌的抑制作用，再运用网络药理学的思路和方法,预测神效瓜蒌散作用于乳腺癌的靶点,运用Western验证蛋白，探讨神效瓜蒌散作用乳腺癌的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 神效瓜蒌散的瓜蒌、甘草、当归、乳香和没药均购买自北京同仁堂大药房。药物经过浸泡、煮沸、过滤、旋蒸、冻干等步骤得到神效瓜蒌散的水提物。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 人乳腺癌细胞系SKBR-3细胞培养在含10%胎牛血清的1640培养基于37℃，95%的空气和5%CO2的饱和湿度下培养。SKBR-3购买自中国科学院肿瘤细胞库。

1.2.2 细胞增殖实验 细胞增殖试验采用台盼蓝染色法和MTS法检测细胞存活和增殖情况。台盼蓝染色法是对数增长的乳腺癌SKBR-3细胞1×104/孔密度铺在24孔板培养，设置空白对照组、神效瓜蒌散剂量组（50、100、200、300 和 400 μg/mL），细胞计数使用0.4%的台盼蓝计数。MTS法将对数增长的乳腺癌SKBR-3细胞1×104/mL铺在96孔板培养，设置空白对照组、神效瓜蒌散剂量组（50、100、200、300和400μg/mL），每孔加入 20μLMTS，用美国 Bio-Rad微孔板光度计在490 nm处测定吸光度（OD）值。

1.2.3 划痕实验 细胞划痕实验将对数增长的乳腺癌SKBR-3细胞（10×104）铺在24孔板培养，设置空白对照组、神效瓜蒌散剂量组（50、100、200、300和400μg/mL），划痕分别在0、6、12、24和48h拍照。

1.2.4 Western blot实验 对数增长的乳腺癌SKBR-3细胞（20×104）铺在6孔板培养，设置空白对照组、神效瓜蒌散剂量组（100、200 μg/mL），收集培养72 h后的细胞,裂解细胞提取蛋白。采用Western blot法检测ERα的表达水平,以β-actin为空白对照,操作均严格按照试剂盒说明书进行。

1.3 网络药理学方法

1.3.1 药物有效成分的收集和靶点预测 通过先前研究[11]，神效瓜蒌散的5个药物成分分别从TCMSP数据库、TCMID数据库等数据库查找有效成分，其中按照类药性＞0.18筛选有效成分，再通过pubchem、drugbank、chemmapper等数据库根据药物结构的相似性找到有效成分相应靶点。

1.3.2 乳腺癌的靶点预测 乳腺癌的靶点通过网络数据库 TTD（Therapeutic Target Database）和 Pubmed、知网等数据库文献中筛选。

1.3.3 网络构建和分析 将预测到神效瓜蒌散的有效成分的靶点和乳腺癌的预测靶点进行匹配，并通过Cytoscape软件,根据成分与靶点关联的程度、匹配的程度制作对应中药的成分-靶点网络图，并对其进行归纳和总结。

1.4 统计学分析 图标使用Excel、PowerPoint和GraphPad Prism 5生成图形。使用社会科学SPSS12.0的统计软件包确定统计显著性。

2 结果

2.1 神效瓜蒌散水提物的提取结果 买自北京同仁堂的神效瓜蒌散240 g经过浸泡、煮沸、过滤、旋蒸、冻干等步骤得到110 g神效瓜蒌散水提物。

2.2 细胞增殖实验结果

2.2.1 台盼蓝法结果 使用台盼蓝法加入不同剂量神效瓜蒌散（50、100、200 、300 和 400 μg/mL）后，连续计数乳腺癌SKBR-3细胞6 d，观察不同剂量组细胞数目变化和差异，发现在剂量为50 μg/mL的低剂量组就出现细胞数目的明显减少，并且呈剂量依赖性，且在第3天细胞数目开始明显减少，呈时间依赖性（P＜0.05），见图1。

图1 SKBR-3细胞在不同剂量药物台盼蓝计数Fig 1 SKBR 3 cells trypan blue countings at different doses

2.2.2 MTS法结果 MTS实验设置空白对照组、不同剂量神效瓜蒌散（50、100、200、300 和 400 μg/mL）组后，72hOD值见图2，从图中可以看出，随着神效瓜蒌散浓度的增加，OD值呈剂量依赖性下降（P＜0.05）。

图2 SKBR-3细胞在不同剂量组药物MTS的OD值Fig 2 OD value of the MTS for SKBR 3 cells at different dose drugs

台盼蓝法和MTS实验说明神效瓜蒌散能够抑制乳腺癌细胞SKBR-3增殖，且呈剂量、时间依赖性。2.3 划痕实验结果 为了初步探索神效瓜蒌散与乳腺癌SKBR-3细胞迁移的关系，采用划痕实验方法。划痕实验设置对照组、不同剂量神效瓜蒌散（100、200 μg/mL）组后，24 h 实验结果见图 3，从图中可以看出和空白对照组相比，各加药组细胞迁移的距离明显减少，说明神效瓜蒌散能够抑制乳腺癌细胞SKBR-3的迁移，且呈剂量依赖性。

图3 SKBR-3细胞在不同剂量组药物的24 h划痕（4×100）Fig 3 SKBR 3 cell scratches at different doses for 24 h（4×100）

2.4 网络药理学结果

2.4.1 药物有效成分的收集和靶点预测结果 神效瓜蒌散的瓜蒌、甘草、当归、乳香和没药5个成分，通过TCMSP数据库、TCMID数据库等数据库，按照类药性＞0.18筛查到的有效成分及通过pubchem、drugbank、chemmapper等数据库找到药物的有效成分和靶点情况见表1。

表1 神效瓜蒌散组分的有效成分、预测靶点结果Tab 1 Active ingredients in Shenxiaogualousan and its predicted target results

2.4.2 乳腺癌的靶点预测结果 乳腺癌通过TTD数据库筛选到靶点80个，通过Pubmed、知网等数据库文献查找到41个靶点，所以乳腺癌的靶点一共121个。

2.4.3 网络构建和分析结果 通过神效瓜蒌散的有效成分和预测靶点与乳腺癌的靶点匹配后，用Cytoscape软件构建的神效瓜蒌散成分靶点网络图见图4，从图中可见神效瓜蒌散靠前的靶点是ER、HSP90等，可以推测神效瓜蒌散通过ER、HSP90等靶点作用于乳腺癌发挥其抗肿瘤作用。

图4 神效瓜蒌散的成分靶点网络图Fig 4 Target network diagram for Shenxiaogualousan ingredients

2.5 神效瓜蒌散对ERα作用结果 网络药理学分析神效瓜蒌散可能主要通过作用于ER发挥抗乳腺癌作用，为此笔者检测了神效瓜蒌散作用的乳腺癌细胞SKB的ERα的表达以验证网络药理学分析的预测结果。结果显示：加入不同浓度的神效瓜蒌散（0、100、200 μg/mL）后，随着药物剂量的增加，ERα逐渐减少（P＜0.05），见图 5。Western blot实验结果与网络药理学预测机制部分吻合。

图5 神效瓜蒌散对乳腺癌细胞SKB的ERα表达的影响Fig 5 Shenxiaogualousan impact on breast cancer cells of SKB expression of ER alpha

3 讨论

通过实验结果表明，神效瓜蒌散能够在体外抑制乳腺癌细胞SKBR-3的增殖和迁移，并且呈剂量依赖性。网络药理学建立的成分靶点图，排在前两位分别是ER、HSP90。

乳腺癌是世界范围内确诊率最高的癌症，其中75%的乳腺癌是雌激素ER阳性，雌激素长期过度刺激、ER表达水平增高或转录激活活性增强，是导致乳腺癌的重要原因[13]，1896年,Beatson医生首先对乳腺癌患者进行了卵巢切除术,开创了针对雌激素治疗的先河。如今ER受体已经是乳腺癌内分泌治疗的作用靶点，是乳腺癌治疗的主要方法之一，多数临床研究结果显示内分泌辅助治疗可以显著降低乳腺癌复发率并延长生存期。雌激素的生物学效应主要通过雌激素受体介导的对下游靶基因转录激活或抑制效应来实现，雌激素有两个受体,ERα与ERβ,研究表明在乳腺中以ERα为主,ERα过度激活是雌激素依赖性乳腺癌发生与进展的重要因素[12]。雌激素的核受体按照结构和功能主要分为2类：类固醇激素受体家族和甲状腺受体家族，类固醇激素受体未活化状态时与热休克蛋白结合存在，配体与受体结合使热休克蛋白与受体解离[13]。

热休克蛋白（HSP）是高度保守的应激蛋白，在细胞中作为分子伴侣参与蛋白质的折叠、转运、逆转录许多关键调节因子的蛋白水解过程,从而影响细胞生长、分化和生存[14-15]。热休克蛋白通常按照分子量不同，分为HSP70和HSP90，其中HSP90又分为HSP90α和HSP90β两种亚型，两者同源性高达84%，其中HSP90在雌激素的信号传导中起重要作用即当雌激素受体未与雌激素结合时，细胞内的ER和HSP90形成ER-HSP 90复合物,雌激素和ER结合后，HSP90分离,雌激素受体激活发挥生物学效应[15]。研究表明，HSP90的过高水平的表达与乳腺癌患者的不良预后相关[16]。

神效瓜蒌散从宋代以来就用来治疗乳腺癌，本研究利用网络药理学的方法，发现其发挥抗乳腺癌作用可能主要是通过内分泌通路，今后可以进一步研究神效瓜蒌散通过内分泌通路治疗乳腺癌的具体机制以及可能存在的其他抗乳腺癌的通路。