气相色谱法测定药物中间体2-甲基咪唑中乙醛的残留量

翁秀芳，董卫莉，张慕军

（1.天津医科大学药学院药物化学教研室，天津市临床药物关键技术重点实验室，天津300070；2.天津药物研究院原料药研究中心，天津300193）

甲硝唑是硝基咪唑类抗生素，具有抗感染的作用，是抗厌氧菌的首选药物[1]，临床上多用于抗阿米巴原虫、抗滴虫，艰难梭菌感染的腹泻的治疗[2]。二甲硝咪唑对黑头组织滴虫、鞭毛虫等原虫，及坏死厌氧丝杆菌、肠弧菌等细菌，具有显著抑制作用。2-甲基咪唑是用于生产甲硝唑和二甲硝唑等药物的中间体[3-4]，可用作环氧树脂等固化剂，纤维织品染料的辅助剂，制备泡沫塑料时的添加剂。

以乙醛、乙二醛、氨为原料经Redziszewsk反应，可一步生成2-甲基咪唑，该法反应后，于减压下浓缩，冷却至室温，析出结晶即为产品，经分离后，母液经进一步分离处理也可得到含量约90%的产品。此法反应条件比较温和，原料易得，工艺简单，操作方便，设备要求不高，反应收率为80%以上，成本较低，这是目前国内大多数厂家采用的方法。其反应方程式如下[5]：

乙醛是一种无色、有强烈的刺激性气味易流动液体，易溶于水、醇类等。乙醛是酒精中酵母发酵的中间代谢物，是一种致癌物质[6-7]。研究表明，乙醛的毒性大约是酒精毒性的5.3倍[8]，其能与机体内的各种蛋白质或膜物质结合，形成乙醛-蛋白质加合物而干扰多种酶的催化性质，影响细胞内多种代谢途径和生物膜的完整性。乙醛与微管的结构蛋白(微管蛋白)的高反应性赖氨酸残基结合，结果损害了微管的聚合和结构，并抑制了蛋白质、脂蛋白和糖蛋白的分泌[9]。世界卫生组织已经将乙醛列为2类致癌物质清单中。因此，需要对乙醛的残留量加以控制。由于乙醛为小分子化合物，易挥发，并且在紫外区的吸收较低，无法进行高效液相色谱法检测。文献报道乙醛的测定方法主要有衍生化法（液相色谱[10-13]或紫外分光光度计测定[14]）、气相色谱法（顶空进样[15-16]）等。衍生化法操作复杂，实验步骤繁多，且衍生化试剂具有较大毒性，未采用该方法。采用顶空进样法测定乙醛时，笔者在实验中发现利用该方法测定乙醛，加样回收率只有20%～27%。因为乙醛沸点较低，仅20.8℃，化学性质活泼，在持续高温条件下，2-甲基咪唑会提供碱性环境，碱与乙醛中的α-氢结合，形成一个碳负离子，作为亲核试剂，立即进攻另一个乙醛分子中的羰基碳原子，发生加成反应，生成烷氧负离子，再结合一个质子，形成β-羟基醛，β-羟基醛受热易脱水生成α，β-不饱和醛。故不能采用该方法测定乙醛残留量。

本研究的目的是建立一种采用气相色谱检测2-甲基咪唑中乙醛残留量的方法。该操作简单，分析速度快、毒性较小，可以消除样品对乙醛测定的干扰。该方法根据ICH指导原则进行方法学验证[17]，具有一定的准确度、精密度和耐用性，从而测定乙醛的残留量[18]。

1 材料与方法

1.1 仪器 Agilent 7890B气相色谱仪（安捷伦，美国）和G4513A自动进样器（安捷伦，美国），火焰离子检测器（安捷伦，美国），Metter XS205DV电子天平（梅特勒-托利多，瑞士）。

1.2 试药 乙腈（色谱纯,德国默克），乙醛（无水级，Aladdin，批号 J1709020），2-甲基咪唑（平湖艾泊有限公司，20180120；嘉兴艾森有限公司，20171011、20171220、20171220；湖北兴银河化工公司，M-2017101501）。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件 采用Aglilent DB-624色谱柱（75 m × 530 μm × 3 μm），液体进样，进样量为 2 μL；进样口温度为250℃；检测器温度为280℃；分流比为 5：1；载气为 N2；恒流，流速 6 mL·min-1；恒温：起始温度50℃，保持5.5 min；后运行：温度为240℃，保持 10.5 min，流量为 8 mL·min-1。

1.3.2 乙醛残留量的计算

AS：供试品溶液中乙醛的峰面积；Cs：供试品溶液的溶度（mg·mL-1）

AR：对照品溶液中乙醛的峰面积；CR：对照品溶液的浓度（mg·mL-1）。

1.3.3 溶液的制备 （1）供试品溶液的制备：取2-甲基咪唑适量，精密称定，用乙腈溶解并定量稀释成每1 mL含有2-甲基咪唑20 mg，作为供试品溶液。

（2）对照品溶液的制备：取无水级乙醛适量，精密称定，用乙腈溶解并稀释成每1 mL含有乙醛400 μg，作为乙醛对照品储备液。精密吸取0.75 mL乙醛对照品储备液置于100 mL容量瓶中，加入乙腈稀释并制成每1mL含有乙醛3μg，作为对照品溶液。

1.3.4 系统适应性试验 精密吸取乙醛对照品储备液2.5 mL，置于10 mL容量瓶中加入乙腈稀释并定容至刻度；作为系统适应性溶液，按色谱条件连续进样分析6次，并记录色谱图。

1.3.5 专属性试验 制备适量浓度的乙二醛溶液、供试品溶液、乙醛对照溶液及纯乙腈，分别进样各分析1次，记录谱图。

1.3.6 灵敏度试验

1.3.6.1 检出限和定量限：将乙醛对照品储备溶液逐级稀释，要求检出限（LOD,limit of detection）信噪比不小于3，定量限（LOQ,limit of quantity）的信噪比不小于10。

1.3.6.2 检出限和定量限的重复性：制备乙醛的LOD溶液，按色谱条件进样分析3次，计算相对标准偏差。

1.3.6.3 定量限的准确度：将6份加入定量限浓度乙醛的供试品溶液，按色谱条件依次进样分析1次，计算相对标准偏差。

1.3.7 线性关系考察 在定量限至一定的浓度范围内（包括限度浓度）制备6份浓度不同的乙醛溶液，依次进样分析3次，以峰面积为纵坐标，乙醛溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数。

1.3.8 精密度试验 精密度实验需要进行重复性实验和中间精密度实验。

（1）重复性：将6份加入限度浓度乙醛的供试品溶液，按色谱条件依次进样分析1次，计算回收率。

（2）中间精密度：由不同的实验人员在不同的时间、不同的仪器，使用不同的试剂，以6份加入限度浓度乙醛的供试品溶液，按色谱条件依次进样分析1次，分别计算12个供试品溶液回收率。

1.3.9 准确度 将加入80%的限度浓度乙醛、100%限度浓度乙醛、120%限度浓度乙醛的供试品溶液各3份，按色谱条件依次进样分析1次，计算回收率。

1.3.10 耐用性 将加入限度浓度乙醛的供试品溶

液分别以柱流量为5.5 mL·min-1和6.5 mL·min-1替代6 mL·min-1，其他条件保持不变。以柱温48℃和52℃替代50℃，其他条件不变以及正常色谱条件下，依次进样分析两次，分别计算不同变化条件下的回收率。

1.3.11 稳定性 将对照品溶液、供试品溶液、加入限度溶液的供试品溶液，在25 h内取n（n≥10）个时间点，各溶液分别进行分析1次。分别计算n个对照品溶液中乙醛峰面积和RSD，n个供试品溶液中乙醛峰面积和RSD。

1.3.12 样品检测 将限度浓度的乙醛溶液加入5批不同批号的2-甲基咪唑供试品溶液中，每个供试品溶液按色谱条件依次进样分析1次，计算乙醛残留量。

2 结果

2.1 系统适应性结果 当采用气相色谱方法进行检测或者方法学前，通常是需要确认色谱系统能够满足当前的分析要求。这种测试的实质是电路、仪器、样品和分析操作构成整个系统，需要做一个整体评价。制备新的系统适应性溶液进行测试，结果见表1。

表1 系统适应性试验结果Tab 1 Results for System Suitability

由表1可知，乙醛峰面积的RSD（n=6）为0.70%＜2.0%，保留时间 RSD（n=6）为 0＜1.0%，拖尾因子＜2.0，理论塔板数＞50 000，符合系统适应性要求。

2.2 专属性结果 样品中可能存在其他成分的情况下，所用分析方法能够准确地、选择性地检识被测组分的能力，又称为选择性或专一性。主要是考察杂质及其他成分对待检成分测定结果的影响，通过空白试验来考察。结果见图1～3。结果表明空白乙腈对检测乙醛无干扰，乙二醛、2-甲基咪唑中及其杂质在5.5 min内均无检出，该方法专属性良好。

2.3 灵敏度结果 实验得乙醛的检出限为0.55 μg·mL-1，定量限为 1.3 μg·mL-1，LOD 三针的保留时间RSD（n=3）=0.022% ＜1.0%；LOQ 六针的保留时间的RSD（n=6）=0.01% ＜ 1.0%，六针峰面积的 RSD（n=6）=1.22%＜6%，均符合要求，证明该方法具有较好的灵敏度。LOQ的6个加样回收率在100.26～103.14均在药典规定的回收率限度85%～110%的范围内，且RSD（n=6）=1.31%小于药典规定的RSD可接受范围4%。该方法具有一定的灵敏度。

图1 空白乙腈GC色谱图Fig 1 Chromatogram of acetonitrile

图2 乙醛GC色谱图Fig 2 Chromatogram of acetaldehyde

图3 混合溶液GC色谱图Fig 3 Chromatogram of mixed solution

2.4 线性关系考察结果 由下图可知，乙醛在1.36～188.96 μg·mL-1内线性关系良好，线性方程为Y=1.916 8X-0.413，截距的绝对值0.413小于100%响应值的25%，线性方程的相关系数＞0.998，且6个响应因子RSD（n=6）＜10.0%。表明其浓度与峰面积有良好的线性关系。

图4 线性范围考察结果图Fig 4 Results for Linearity

2.5 精密度结果 重复性试验的6个加样回收率在97.63%～100.08%均在85.0%～110.0%的范围内，且RSD（n=6）=0.91%小于4.0%。均符合药典要求。表明该方法重复性良好。12份供试液回收率的RSD(n=12）=1.26%＜4.0%，表明该实验方法的中间精密度良好。

2.6 准确度结果 由表2可知，3个浓度的9个加样回收率在99.74%～102.87%均在85.0%～110.0%的范围内，且9个加样回收率的RSD（n=9）=1.19%小于4.0%，均符合药典要求。表明该方法准确度良好。

表2 准确度试验结果Tab 2 Results for accuracy

2.7 耐用性结果 实验结果表明，当流速在（6±0.5）mL·min-1变化，6个回收率均在 85.0%～110.0%的范围内，且6个回收率的RSD（n=6）=0.89%小于2.0%；起始柱温在（50±2）℃变化，6个回收率均在85.0%～110.0%的范围内，且 RSD（n=6）=1.97%小于2.0%，证明该方法的耐用性较好。

2.8 稳定性结果 实验结果表明，样品供试液在25 h内无乙醛产生；乙醛对照品溶液在25 h内峰面积 RSD（n=13）=1.06%＜4.0%；26个加样的乙醛回收率在85.0%～110.0%范围内，峰面积 RSD（n=26）=0.81%＜4.0%，表明样品溶液、乙醛对照品溶液、加样溶液在25 h内是稳定的。

2.9 测样结果 结果表明，5批样品中乙醛的含量均低于最低检出限，未能检出，故5批样品均合格。

3 讨论

3.1 色谱柱的筛选 先后采用极性不同的色谱柱Agilent DB-1（30 m×0.53 mm×3 μm），Agilent DB-624（30 m×0.53 mm×3 μm），Agilent DB-WAX（30 m×0.53 mm×1μm），Agilent-FFAP （60m×530μm×3μm），根据目标峰的保留时间、拖尾因子和理论塔板数及分离度，选择Agilent DB-624毛细管柱，由于乙醛沸点很低，故采用 Aglilent DB-624（75 m×530 μm×3 μm）毛细管柱增加乙醛的保留。

3.2 柱温和柱流量的筛选 根据乙醛性质活泼，出峰时间较早，样品2-甲基咪唑对其测定无干扰，故采用柱温恒温，后运行高纯氮尾吹的方法，目的是将2-甲基咪唑和高沸点杂质吹出色谱柱。根据目标峰的保留时间、拖尾因子和理论塔板数及分离度，确定柱温、柱流量。恒温：起始温度50℃，保持5.5 min；后运行：温度为240℃，保持10.5 min，流量为 8 mL·min-1。

本文的目的是开发出一种快速、简易、环保的采用液体直接进样方式检测乙醛残留量的气相色谱方法。从最经济最耐用的非极性毛细管柱到极性毛细管柱进行筛选，从不同的起始柱温、升温速率及柱流量进行了色谱条件的优化来确定最佳检测参数。乙醛溶剂残留在药典及ICH中没有明确的限量要求，通过查阅以往药品注册数据、乙醛相关毒理学数据及美国政府工业卫生学家会议推荐接触限值，确定乙醛的限度为150 ppm。本方法根据ICH分析方法验证指导原则从系统适应性、专属性、灵敏度、线性、精密度、准确度、耐用性、溶液稳定性等方面对药物中间体2-甲基咪唑中乙醛的残留量进行方法学研究，结果表明该方法专属性强，灵敏度高，结果准确可靠，具有良好的耐用性和稳定性。