α-突触核蛋白对小鼠BV2细胞凋亡的影响及司来吉兰的干预作用

高 宇,沈 静,宋莲莲,南光贤*

(1.吉林大学中日联谊医院 神经内科,吉林 长春130033;2.吉林省中医药科学院)

α-突触核蛋白(α-synuclein，α-Syn)是由 140 个氨基酸构成的小分子蛋白质，在正常情况下主要以可溶性的单体形式存在于神经元[1]。然而，α-Syn 的代谢发生障碍，使其在神经细胞内异常积聚，进而聚集成纤维而以包涵体的形式沉积在神经细胞内[2]，形成突触核蛋白病(α-synucleinopathy)包括帕金森病路易体痴呆(dementia with Lewy bodies，DLB)及多系统萎缩(multiple system atrophy，MSA)的标志性病理改变。细胞凋亡是由机体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致细胞死亡的过程，凋亡异常往往引起多种疾病,如癌症、自身免疫性疾病、神经退行性疾病等[3]。因此，本研究将利用小鼠BV2 神经胶质细胞株，通过体外研究技术，研究α-Syn寡聚体 对小鼠BV2 神经胶质细胞凋亡的影响及可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

BV2细胞购自于武汉普诺赛生命科技有限公司,MEM 培养基购自于美国 Hyclone 公司;胎牛血清由元亨生物科技有限公司提供； DMSO，北京化学试剂厂产品，3-NP购自于美国 Sigma 公司(纯度为 98%)，盐酸司来吉兰片购自于山东绿叶制药有限公司，α-synuclein(≥90%)购自于美国 Sigma 公司。主要仪器有细胞培养箱，日本三洋公司产品；超净台，苏州净化仪器厂生产；倒置显微镜，日本奥林巴斯有限公司产品，流式细胞仪，美国BD公司产品。NIS-ELEMT BR图像分析软件，日本尼康。

1.2 细胞培养与药物处理

1.2.1细胞培养 小鼠BV2细胞培养于含 10%小牛血清的MEM培养基中,置于 37℃,5%CO2孵箱中培养,其中加入 100 U/mL青霉素,100 mg/L链霉素。培养 24 h后换液。细胞传代时,先吸去瓶中的培养基,加入适量的 0.25%胰蛋白酶消化后轻轻吹打,以吹散细胞团,取对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2药物处理 200 μmol/L α-synuclein 溶液的配制，准确称取 0.5 mg α-synuclein 溶于 173 μl缓冲液中。观察细胞的变化。将对数生长期的细胞按所需浓度接种，4 h后细胞完全贴壁，分别设为空白对照组，α-Syn组，α-Syn+司来吉兰组，每组培养24 h，收集各组细胞进行以下相应实验，每个浓度均作8 个复孔,混匀培养。每个实验重复3次。

1.3 细胞培养四氮唑蓝实验法(MTT 法)

取对数生长期的BV2细胞.分别以 1×104的浓度接种于 96 孔板,每孔 200 μl,置于 37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中孵育；按上述分组用药物处理,在给药后分别培养 24 h；达到预期培养时间前 4 h 终止培养,每孔加入MTT(5 mg/ml)20 μl,37℃孵育4 h,去除上清液。 每孔加入 200 μl DMSO,充分吹打震荡,待蓝色颗粒完全溶解后用酶标仪检测 492 nm 的光密度值,计算存活率(存活率 =毒物作用组光密度值/正常对照组光 密度值 ×100%)。

1.4 采用TUNEl法检测细胞凋亡

采用6孔板制作细胞爬片，4%多聚甲醛在常温下固定30 min,PBS洗2 min×2次，蒸馏水洗涤2 min×2次，试验操作按武汉博世德生物技术有限公司试剂说明书进行。TUNEL染色中细胞凋亡阳性物质呈棕黄色位于细胞核内，部分细胞浆也可因核DNA碎片的逸出呈阳性着色；阴性细胞呈蓝色。每张涂片在400X高倍镜下观察5个视野，每个视野下分别计数凋亡细胞和总细胞数并计算凋亡指数(Apoptosis Index,AI)，求其平均值。AI(%)=凋亡细胞数/总细胞数×100%。每个指标做3次，每次TUNEL染色中以不含TdT的TdT buffer代替TUNEL反应混合液作阴性对照。

1.5 免疫细胞化学染色检测 bcl-2、 bax、caspase-3、Caspase-9蛋白表达

采用6孔板制作细胞爬片，4%多聚甲醛固定后，空气中晾干，采用免疫组化染色观察相应蛋白表达。bcl-2、bax在胞质中呈棕黄色阳性表达；Caspase-3和 Caspase-9主要在胞质中表达。以细胞未着色或轻微着色为阴性。每一指标观察3张细胞爬片，每张片在400X高倍镜下观察5个视野，每个视野下分别采用NIS-ELEMT BR分析阳性物质表达的平均光密度值。免疫细胞化学染色中以已知阳性物质的组织切片为阳性对照，各组均以PBS代替一抗作阴性对照。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 MTT法测定α-Syn及司来吉兰处理后BV2细胞增殖的影响

表1结果显示，α-Syn终浓度20 mM可以抑制BV2细胞生长，司来吉兰100 μM可以明显有效保护BV2细胞的生存(P<0.01)。

表1 司来吉兰对抗α-Syn毒性的保护作用24hMTT结果

注：与α-Syn同浓度细胞生长抑制率比较，※※P<0.01。

2.2 TUNEL法检测细胞凋亡

表2结果显示，α-Syn终浓度20 mM可以导致BV2细胞凋亡，司来吉兰100 μM可以明显有效保护BV2细胞(P<0.01)。(见图1-图3)

图1 对照组tunel(×400) 图2 α-Syn组tunel(×400) 图3 司来吉兰+α-Syn tunel(×400)

表2 司来吉兰对抗α-Syn细胞凋亡作用

注：与α-Syn同浓度细胞生长抑制率比较，※※P<0.01。

2.3 免疫细胞化学染色法检测

表3结果显示，各组凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax 、Caspase-9与Caspase-3均有表达，并且表达具有一致性，从视野内的细胞着色的深浅可以看出表达程度的增多和表达量的增加；统计分析可知：司来吉兰100 μM可以明显有效减少BV2细胞相关蛋白的表达量(P<0.01)。(见图4-图15)

表3 各组凋亡相关蛋白表达平均光密度值

注：与α-Syn同浓度数值比较，※※P<0.01。

图4 对照组Bcl-2(×400) 图5 α-Syn组Bcl-2(×400) 图6 α-Syn+司来吉兰Bcl-2(×400)

图7 对照组Bax(×400) 图8 α-Syn组Bax(×400) 图9 司来吉兰+α-Syn Bax(×400)

图10 对照组caspase-3(×400) 图11 α-Syn组caspase-3(×400) 图12司来吉兰+α-Syn caspase-3

(×400)

图13 对照组caspase-9(×400) 图14 α-Syn组caspase-9(×400) 图15司来吉兰+α-Syn caspase-9

(×400)

3 讨论

α-突触核蛋白的生理作用尚不明确。据报道它可以参与调节细胞的生长和分化、突触可塑性和递质的释放以及参与某些信号传导通路的调节[4]。Seo等研究发现低浓度的α-突触核蛋白具有神经保护作用；高浓度的α-突触核蛋白则表现为神经毒性作用[5]。但是，α-Syn 在病理情况下的异常高表达是否影响神经胶质细胞的凋亡尚未明确。 本研究以BV2 细胞为模型，体外研究高水平的 α-突触核蛋白对细胞凋亡的作用。

在细胞凋亡的过程中， Bcl-2家族蛋白是细胞凋亡的关键调节分子[6]。根据其结构和功能分为抗凋亡基因及促凋亡基因，促凋亡蛋白包括Bax、Bak、Bok、Bad、Bid、Bim、Bmf、Bik、Hrk、Noxa、Puma等，抗凋亡蛋白包括Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-w、Mcl-1、Bcl-B等，正常情况下抗凋亡蛋白发挥作用可抑制凋亡的发生，当细胞受到损伤或胁迫时，抗凋亡蛋白功能受到抑制，而促凋亡蛋白发挥作用，从而引起细胞凋亡[7]。本结果表明，α-Syn 高表达导致bcl-2基因表达明显降低，而Bax基因表达明显升高，α-Syn组凋亡指数较对照组明显增加，表明bcl-2/Bax参与α-Syn 高表达导致BV2 细胞凋亡，而司来吉兰可以减少α-Syn 高表达诱导的BV2细胞凋亡。

诱导细胞凋亡必要的信号分子是一类半胱氨酸蛋白酶称为Caspases家族。该家族共有十几个成员，可以彼此之间互相活化形成级联反应[8]。Caspases在凋亡程序的启动和执行过程中起着重要作用，直接参与凋亡的早期启动、凋亡信号传递及凋亡晚期事件，导致细胞皱缩、膜出泡及DNA断裂等凋亡特征现象[9]。即Caspases分为启动型和执行型，前者接受死亡信号、启动凋亡或激活下游的分子，包括Caspases-2、Caspases-8、Caspases-9、 Caspases-10等；后者则降解细胞骨架、蛋白质、核酸等，包括Caspases-3、 Caspases-6、Caspases-7等[10]。本研究结果表明，α-Syn 高表达导致Caspases-9、Caspases-3表达明显升高，说明α-Syn诱导BV2细胞凋亡是通过线粒体细胞色素C介导的凋亡通路，启动Caspase级联反应，导致细胞凋亡。 而司来吉兰可以降低α-Syn 高表达导致的Caspases-9、Caspases-3表达升高，减少细胞凋亡。

本研究探讨了α-Syn 高表达对BV2 细胞凋亡的作用，为揭示 PD 及 DLB 等与 α-Syn 相关的神经退行性疾病的机制提供了线索。