microRNA-218通过靶向HOXA10抑制肝癌细胞的实验研究

肖钟迪,王雅丽,付 凯

(1.大庆油田总医院 普外科,黑龙江 大庆163001;2.吉林大学中日联谊医院 输血科; 3.哈尔滨医科大学附属第一医院 胸外科)

微小RNA(microRNA,miRNAs)是一类长约22个核苷酸的单链非编码RNA,通过与靶mRNAs完全或不完全互补配对,导致靶基因降解或抑制其翻译,从而在基因的表达调控中发挥着重要作用。研究表明microRNAs参与了肝癌的发生、发展和侵袭转移的全过程[1,2]但是有关miR-218在肝癌(HCC)的生物学功能仍然未知,本研究将通过qRT-PCR方法检测miR-218在肝癌细胞和肝癌组织的表达情况,以及探索miR-218对肝癌细胞系增殖、侵袭和转移的影响和具体机制。

1 材料与方法

1.1 细胞系肝癌细胞系BEL-7402,MHCC97L,MHCC97H,QGY-7703,Huh7,HepG2,和正常肝细胞系THLE-2 购自ATCC公司(ATCC,USA)。所有的细胞系均培养在含有10%胎牛血清的DMEM培养液中。

1.2miR-218模拟物(mimics)和阴性miRNA(miR-NC)购自广州锐博有限公司(RiboBio,Guangzhou,China)。Hoxa10过表达载体pcDNA3.1-Hoxa10和对照载体pcDNA3.1购自Amspring(长沙,China)。各种细胞系种植到不同孔板中,起始密度约70%左右,细胞过夜之后,利用脂质体2000(Thermo Fisher Scientific,USA)进行转染,转染过程按照说明书进行。

1.3 肝癌组织标本本研究选取2011-2013年大庆油田总医院普外科肝癌患者30名,均为汉族,其中男性17名,女性13名,年龄25-68岁。所有的样本采集均获得了患者知情同意,检测完全符合大庆油田总医院伦理道德标准并通过伦理审查。

1.4 RT-qPCR检测利用TRIzol试剂(Thermo Fisher Scientific,USA)提取肝癌组织和肝癌细胞的RNA。TaqMan microRNA逆转录试剂盒合成单链cDNA,TaqMan microRNA PCR (Thermo Fisher Scientific,USA)检测miR-218表达情况。miR-218引物为5′-CGGGATCCGACCAGTCGCTGCGGGGCTTTCCTTTGTGCTTGATCTAACC-

ATGTGGTGGAACGATGGAAA-3′和5′-CCCA-

AGCTTTGCAGGAGAGCACGGTGCTTTC CGC-

GGTGCTTGACAGAACCATGTTCCGTTTCCA-

TCGTTC-3,U6作为对照microRNA。结果采用2-ΔΔCT方法进行miR-218定量分析,每个样本至少重复3次,进行统计学分析。

1.5 CCK-8检测实验应用CCK-8检测试剂盒进行细胞增殖实验。约2000个转染细胞种植到96孔板中,细胞孵育在37℃和5%的CO2孵育箱中。0,24,48,72 h孵育之后,每个细胞孔中分别加入10 μl的CCK-8 (Solarbio,中国),再次将培养板放在培养箱中孵育2 h,最后用酶标仪在450 nm处检测吸光度值。每个样本至少重复3次,进行统计学分析。

1.6 细胞迁移实验获取各组转染的细胞并将其重悬到不含小牛血清的DMEM中,1×105细胞孵育到Matrigel凝胶包被的24孔板迁移小室的上层(Corning,USA),下层小室加入500 μl含20%FBS的DMEM培养基。24 h孵育之后,侵袭细胞经过4%多聚甲醛固定后,用0.1%结晶紫进行染色,最后显微镜进行计数,拍照并做统计学分析。

1.7 生物信息分析和荧光素酶报告基因实验利用生物信息学方法,应用miRWalk,miRanda,TargetScan,miRDB等进行靶基因预测。克隆Hoxa10基因野生型(wt)或突变型(mut)的3＇端非编码区(3＇UTR),并将其连接到pGL3载体上。将肝癌细胞培养于24孔板中,待细胞生长到50%左右融合时,利用lipofectamine2000共转染miR-218/miR-NC和pGl3-Hoxa10-wt/mut到肝癌细胞中。48 h后,应用双荧光素酶报告检测系统(Promega)进行测量。重复三次实验后进行统计学分析。

1.8Western blot RIPA裂解液提取细胞和组织的蛋白,蛋白质经过定量之后,经过12%SDS-PAGE分离之后转染至PDMF membrane (Millipore,USA)。5%脱脂奶阻塞1 h后,加入一抗在4℃过夜,二抗在室温下孵育2 h。信号使用ECL Plus system (GE Healthcare,UK)检测。Hoxa10和GAPDH抗体均购自Santa Cruz 公司(Santa Cruz,USA)。

1.9 统计学方法采用SPSS 22.0进行t检验,数值用均值和标准差表示,P<0.05代表有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-218在肝癌组织和肝癌细胞中表达降低利用RT-qPCR检测了30例肝癌患者miR-218的表达情况,结果发现,与癌旁正常组织相比,miR-218在肝癌患者中表达明显降低,具有统计学意义(见图1A)；同时,我们的结果也发现,与正常肝细胞相比,miR-218在肝癌细胞表达明显降低,其中MHCC97H肝癌细胞降低最为明显(见图1B)。根据这些结果,我们在后续的细胞实验中,使用的细胞系均为MHCC97H。这些结果表明miR-218降低可能与肝癌的发生发展和侵袭转移有关。

A．肝癌组织中miR-218表达.B 肝癌细胞中miR-218表达

2.2 miR-218过表达显著降低了肝癌细胞的增殖和侵袭通过miR-218 mimics和miR-NC作用在肝癌细胞MHCC97H中,CCK-8增殖实验发现,与miR-NC相比,miR-218过表达显著降低了肝癌细胞系的增殖(见图2A)。迁移小室实验发现,miR-218过表达显著降低了肝癌细胞系的侵袭(见图2B)。以上结果表明,miR-218过表达能够降低肝癌细胞的增殖和侵袭。

A.CCK-8实验.B.迁移小室实验

2.3 Hoxa10可作为miR-218的直接靶点通过生物信息学分析发现Hoxa10可能是miR-218的直接靶点(见图3A)。荧光报告素酶实验发现,在肝癌细胞系MHCC97H中,miR-218 mimics能够显著减低Hoxa10-wt的荧光素酶活性；而miR-218 mimics却不能影响Hoxa10-mut的荧光素酶活性(见图3B)。同时,Western blot结果发现miR-218 mimics能够显著降低Hoxa10在肝癌细胞MHCC97H的表达(见图3C)。这些结果表明Hoxa10可作为miR-218抑制肝癌的直接靶点。

2.4 过表达Hoxa10部分抵消miR-218对肝癌细胞的抑制作用我们进行了拯救实验以验证miR-218通过作用Hoxa10起到抑制肝癌细胞的作用。我们利用pcDNA3.1-Hoxa10转染到肝癌细胞MHCC97H中,CCK-8和迁移小室实验发现Hoxa10过表达部分削弱了miR-218表达增高引起的肝癌细胞增殖和转移。这些结果表明Hoxa10可以作为miR-218的直接靶点抵消miR-218对肝癌细胞的抑制作用。

A.靶点预测.B.荧光素酶报告基因实验.C.Western blot结果

3 讨论

本研究首先利用RT-qPCR检测了30例肝癌标本和肝癌细胞miR-218的表达情况,结果发现miR-218在肝癌标本和肝癌细胞中表达降低；接着,我们进行了肝癌细胞增殖和侵袭实验,研究发现miR-218过表达可以显著降低肝癌细胞的增殖和侵袭；以上结果表明miR-218可能具有参与肝癌的发生发展、侵袭和转移的作用。

接着,为了进一步研究miR-218抑制肝癌的分子机制,我们利用生物信息学分析发现Hoxa10可能是miR-218的直接靶点,并且通过荧光报告素酶实验进行了验证；拯救实验也表明过表达Hoxa10可以部分抵消miR-218对肝癌细胞增殖和侵袭的抑制作用,以上结果表明,miR-218抑制肝癌细胞增殖和侵袭的主要机制是通过靶向抑制Hoxa10。

在其他的肿瘤研究中,wei[3]等发现miR-218在透明细胞肾细胞癌中表达降低,其抑制透明细胞肾细胞癌的主要是机制是靶向抑制蛋白磷酸酶2A。Li[4]等研究发现miR-218在子宫内膜癌的表达降低,其抑制子宫内膜癌细胞主要通过靶向调节ADD2。

A.CCK-8实验.B.迁移小室实验

Xuan[5]等在骨肉瘤的研究发现miR-218表达降低,其抑制骨肉瘤细胞的主要机制是通过下调E2F2。此外,miR-218在宫颈癌中也表达显著降低,其抑制宫颈癌生长和转移的主要机制是调节NF-κB 信号通路[6]。

综上所述,miR-218通过靶向调节Hoxa10从而抑制肝癌细胞的增殖和侵袭。后续有必要进行小鼠肝癌移植瘤模型的研究,从而进一步阐明miR-218参与肝癌发生发展、侵袭和转移的作用。本研究将为靶向miR-218治疗肝癌提供了坚实的理论基础。