关于医学病原肠道伤寒杆菌毒性实验方法的改进

于 军,贺 丹,张 灵,李洪岩

(吉林大学基础医学院，吉林 长春130021)

病原微生物学是基础医学中最重要的一门课程，也是比较特殊的一门医学基础课程。病原微生物学实验教学，也是当今最受重视的一门教学。在医学病原微生物实验教学中，尤其病原肠道致病菌：伤寒杆菌、痢疾杆菌、大肠杆菌的生化鉴定的实验教学，卫生部公布的《人间传染的病原微生物名录》，将伤寒杆菌、痢疾杆菌病原微生物列为第二类病原微生物，属高致病性病原微生物。根据《名录的规定》，在实验室操作中，肠道致病菌等应在BSL-2或在ABSL-2实验室进行[1-3]。

目前在国外世界卫生组织(WHO为了指导实验室生物安全，减少实验室事故的发生，与1983年出版了《实验室生物安全手册》、各国各部门对生物安全要求都是硬性规定[4]。美国在1974年出版了《微生物和生物医学实验室生物安全手册》首次提出了四级病原微生物危害和四级实验室活动的概念，主要涉及职业卫生、生物安保、风险评估、部分农业病原体、生物毒素等新内容[5]。

我国发布的《人间传染的高致病性病原微生物实验室和实验室活动生物安全审批管理办法》(卫生部第50号令)中也强调：从事高致病性病原微生物实验活动资格必须经过审批，三、四级生物安全实验室从事高致病性病原微生物实验活动，必须取得卫生部颁发的《高致病性病原微生物实验室资格证书》[6-8]。

为了做好病原微生物学肠道杆菌的实验教学，对病原微生物学肠道伤寒杆菌的减毒株的实验研究迫在眉睫。

项目起源于医学病原微生物学临床五年制教学大纲,项目名称为病原性肠道杆菌的分离鉴定(712045).现改革其实验方法[9-12]。

1 材料与方法

1.1 伤寒杆菌临床分离株、伤寒杆菌减毒株

伤寒杆菌临床分离株(TH))由吉林大学基础医学院病原生物学系提供，(均为患者首次入院首次分离株)，伤寒杆菌减毒株(TY21a)、(PQ)由生物制品所提供。上述菌株经法国梅里埃公司VITEK-32 微生物分析鉴定系统鉴定，由吉林大学基础医学院病原生物学系实验室保存。质控菌株： 大肠埃希菌JM101，为基础医学院病原生物学系实验室保存。

1.2 主要试剂

(1)培养基：S-S培养基(Salmonella-Shigella Agar；产品编号：HB4089;青岛高科园海博生物技术有限公司生产；克氏双塘培养基(Kligler Iron Agar)：产品编号：HB6234;青岛高科园海博生物技术有限公司生产；半固体培养基(Semisolid Agar)；产品编号：HB4168-3;青岛高科园海博生物技术有限公司生产)；LB营养琼脂培养基(LB Nutrient Agar,产品编号：HB0129;青岛高科园海博生物技术有限公司生产；LB肉汤培养基(LB Broth),产品编号：HB0128;青岛高科园海博生物技术有限公司生产；肠道编码生化鉴定管：杭州天和公司。

(2)其他：琼脂糖(上海生工生产)；PEG 8000(Merck公司生产)；

1.3 主要仪器和设备

台式离心机(上海安享科学仪器厂)；电子天平(JD400-3型：沈阳龙腾仪器有限公司)；恒温培养振荡器(ZWY-240，上海智城分析仪器制造有限公司)；电热恒温培养箱(DHP-9162，中仪国科(北京)科技有限公司)；恒温孵育摇床,ES-60杭州米欧仪器有限公司。

微波炉(WD800AS-4，格兰仕公司生产)；洁净工作台(SW-CJ-1F，苏州安泰空气技术有限公司)；透射电镜(HITACHI H-7650：日本株式会社日立电器有限公司生产)；医用低温冰箱(MDF-U300，日本松下公司)；生物显微镜(E100型，日本尼康公司)；制冰机(北京长流科技有限公司生产)。

2 方法

2.1 伤寒杆菌

伤寒减毒株的复苏及培养 (伤寒株—TH;伤寒减毒株：TY21a) 、(PQ)。

伤寒杆菌及伤寒减毒株接种LB肉汤培养基于恒温震荡摇床过夜培养，24 h后取出，于LB琼脂平板上分离划，培养8-12 h(37℃)。注意观察细菌生长状态，培养完成后挑单菌落进行接种，接种S-S培养基(Salmonella-Shigella Agar)，通常接种病原性肠道杆菌都选用鉴别培养基。因为S-S培养基成分中含有乳糖、中性红指示剂及抑制非肠道致病菌生长的抑制剂。大肠埃希菌分解乳糖产酸，指示剂显示成红色。伤寒杆菌临床分离株及伤寒减毒株不分解乳糖，生成透明菌落。有些肠道杆菌长生硫化氢，故有黑色生成。

图1 伤寒减毒株PQ及TY21a 的对比性培养实验

图2 伤寒减毒株PQ及TY21a 与原伤寒临床分离株TH

2.2 接种克氏双糖培养基

伤寒杆菌及伤寒减毒株接种克氏双糖培养基(Kligler Iron Agar)，37度24 h培养。图2铁双塘培养基斜面含乳糖、产酸时候酚红指示剂变黄，上层含有枸橼酸铵铁，故可看产生H2S,底部黑色及有无鞭毛。

2.3 伤寒杆菌及伤寒减毒株半固体培养基(Semisolid Agar)

用于观察肠道菌的动力培养基。

半固体培养基可以观察动力。产气时培养基有气泡或崩开，可以观察伤寒杆菌动力。

表1 铁双塘培养伤寒杆菌及伤寒减毒株鉴定对比实验

2.4 肠道编码生化鉴定

2.5 肠道因子血清学鉴定对比试验

沙门菌属应用已知的抗血清测定菌株的抗原成分，用已知的血清抗体与未知的肠道杆菌(抗原)进行玻片凝集试验，定属、定群、定种。通过细菌的培养特性及生化反映可以初步鉴定病原性肠道杆菌，只有通过血清学鉴定才能最后确定检测细菌的属、群、种。

表2 伤寒杆菌及伤寒减毒株生化鉴定对比

+为产酸产气注：糖发酵试验中，-为不发酵，+为产酸产气

图3 伤寒杆菌(TH)及伤寒减毒株(PQ)编码鉴定对比

①沙门氏菌属多价抗“O”血清

②沙门氏菌属组抗“O”因子血清

③型抗“H”因子血清

方法：取一接种环诊断血清放于载玻片上，再从铁双塘培养基上取少许培养物充分研磨混匀，同时生理盐水作对照。

结果：对照均匀浑浊。培养物与诊断血清室温数分钟后肉眼可见颗粒状凝集，为阳性。经过对比，伤寒杆菌及伤寒减毒株皆为阳性。

图4 大肠埃希菌及编码鉴定对照

图5 伤寒杆菌(TH)及减毒株(TY21a)因子血清学鉴定

3 结果

实验结果：S-S培养基伤寒杆菌及伤寒减毒株均生长，革兰染色为革兰阴性菌；铁双塘培养基均生长伤寒杆菌及伤寒减毒株；有H2S产生、有动力。血清学鉴定：诊断血清室温数分钟后肉眼可见颗粒状凝集，伤寒杆菌及伤寒减毒株皆为阳性。由此得出结论：医学生病原微生物学实验课中肠道致病性杆菌的伤寒杆菌，可以用伤寒减毒株(Ty21a)或(PQ)取代[10，11]。这样既可以保持病原微生物学实验课学生的生物安全，医学生可以学习到肠道致病菌的一系列生化特性，掌握全面的致病性肠道杆菌的生物学特性，又可以避免临床分离株对师生造成感染。达到了基础医学病原微生物学实验课程的安全性、系统性、完整性[12，13]。