C-Jun氨基末端激酶与Activin A/Smads通路在体外脑缺血损伤中的相互作用

何金婷,莽 靖，董 玥，徐 磊，梁文昭，王姣琦，徐忠信

(吉林大学中日联谊医院 神经内科，吉林 长春130033)

激活素A(ActA)，是目前较为公认的神经保护因子[1]。研究认为，ActA主要通过Smads依赖的信号转导通路发挥生物学作用，但其活化水平受多种因子的调控，包括卵泡雌激素(FSH)、Smad锚捉蛋白(SARA)等[2,3]。 c-Jun氨基末端激酶(JNK)，作为丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的成员之一，在上皮—间充质转化和癌变过程中与TGF-β/Smads信号通路存在交叉对话[4]。作为转化生长因子β(TGF-β)超家族的成员之一，ActA介导的ActA/Smads信号通路与JNK之间是否也存在着表达调控尚不清楚。本研究通过外源性ActA及JNK抑制剂SP600125干预，初步探讨了ActA/Smads与JNK之间的表达调控关系，为ActA/Smads抗缺血性脑损伤神经保护作用的调控提供潜在位点。

1 材料和方法

1.1 主要材料

大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞购自国家实验细胞资源共享服务平台。鼠神经生长因子(NGF)购自美国Promega公司。外源性ActA蛋白购自美国Sigma公司。JNK拮抗剂SP600125购自美国BioSource公司。小鼠抗大鼠β-actin抗体购自美国Santa公司，兔抗大鼠Smad3、磷酸化Smad3抗体购自美国ThermoFisher公司；兔抗大鼠JNK1、磷酸化JNK1购自Abcam公司。辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠、羊抗兔二抗购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1PC12细胞的培养及神经元样转化 PC12细胞常规培养在含10%马血清和10%胎牛血清的高糖DMEM培养基。根据细胞生长情况及培养液颜色，每2至3天更换一次培养液。当细胞生长接近80 %融合时，使用含有0.25 %的胰酶进行消化传代。利用含有50 ng/ml鼠神经生长因子的去血清DMEM高糖培养液连续培养7天，诱导PC12细胞神经元样转化[5]。

1.2.2氧糖剥夺模型的复制 利用含有1 mM连二亚硫酸钠(NaS2O4)的无糖DMEM培养液于37 ℃，5 % CO2、95 % N2的培养箱中培养神经元样PC12细胞，复制氧糖剥夺(Oxygen Glucose Deprivation，OGD)模型[6]。OGD计时0和1 h。

1.2.3ActA/Smads及JNK信号的干预 为探讨ActA/Smads通路与JNK1信号之间的相互作用，本研究首先将神经元样PC12细胞给与外源性ActA(50 ng/ml)孵育24 h后行OGD处理[7]，以探讨ActA信号活化对JNK1磷酸化激活的影响。其次，将溶解在DMSO中的SP600125以10 μM的浓度处理神经元样PC12细胞30 min[8]，随即行OGD处理，以探讨抑制JNK磷酸化激活对ActA/Smads信号活化的影响。

1.2.4Western blot蛋白水平表达检测 将各组提取的总蛋白按照BCA法测定蛋白浓度后调整上样量。上样蛋白在100 ℃水中煮沸 5 min，随后按照操作步骤进行电泳、转膜、封闭操作。使用含5 %脱脂奶粉的TBST溶液稀释兔抗大鼠Smad3(1∶1000)，磷酸化Smad3(1∶1000)和小鼠抗大鼠β-actin(1∶1000)抗体。一抗4 ℃孵育过夜，次日TBST洗膜，使用羊抗兔或羊抗小鼠的二抗，按照1∶1000的比例室温孵育1 h，TBST洗膜后ECL显影压胶片。凝胶图像分析系统扫描胶片，吸光度分析计算每条目的条带与相应内参条带的灰度值，两者的比值表示目的蛋白的表达水平。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 ActA/Smads信号负性调控JNK磷酸化活化

利用Western blot技术对OGD 0 h和1 h组JNK1总蛋白及磷酸化蛋白的表达进行检测。结果如图1-A和B，OGD1h组JNK1总蛋白及磷酸化蛋白的表达水平较OGD 0h组均升高。给与外源性ActA孵育24 h后行OGD处理，结果如图1-C，空白对照组OGD 0 h组相比，OGD 1 h时Smad3总蛋白及磷酸化水平分别升高了27.0%和61.6%，p-JNK1表达升高了27.1%，差别有统计学意义(P<0.05)。与空白对照组各OGD时间点相比，外源性ActA处理组在OGD 0 h及1 h时Smad3磷酸化蛋白水平分别升高了98.7%和44.7%，JNK1磷酸化蛋白水分别减低了67.8%和56.4%，差别有统计学意义(P<0.05)。

2.2 抑制JNK活化上调Act A/Smads通路活性

Western blot检测JNK1总蛋白及磷酸化蛋白的表达，结果如图2-A和B，与DMSO组及对照组相比，SP600125抑制剂组JNK1总蛋白表达无明显变化，但JNK1的磷酸化水平显著降低。说明SP600125可有效抑制JNK1磷酸化激活。Western blot在对SP600125处理后神经元样PC12细胞ActA/Smads通路活化水平进行检测后发现，抑制剂组Smad3总蛋白在OGD 0h及1h时较相应的DMSO组相应时间点升高47.1%和38.3%，磷酸化Smad3升高142.5%和60.5%，差别有统计学意义(P<0.05，如图2-C和D)。

3 讨论

随着静脉溶栓和血管内介入治疗技术的开展，近年来，针对缺血性脑卒中患者急性期的治疗已经取得了长足的进步[9]。然而，受到缺血时间窗的限制，早期再灌注治疗的临床适应症较少，获益人群非常有限[10]。近期研究发现，早期神经保护策略的启动可以在一定程度上为更多的急性缺血性脑卒中患者血管内治疗赢得时间[11]。然而，在缺乏外源性干预的情况下，内源性神经保护的作用时间有限，致使损伤机制占优，常常掩盖了内源性神经保护的效应。因此，通过对影响内源性神经保护作用时程及效力的潜在位点进行研究和适时干预，将为缺血性脑卒中新治疗方法的研发提供新思路。

ActA是目前较公认的神经保护因子。作为转化生长因子β超家族的成员之一，它主要通过ActA/

(A)JNK1总蛋白及磷酸化蛋白表达检测；(B)JNK1总蛋白及磷酸化蛋白表达的灰度分析；(C)JNK1、Smad3总蛋白及磷酸化蛋白表达检测；(D)JNK1总蛋白及磷酸化蛋白表达的灰度分析；(E)Smad3总蛋白及磷酸化蛋白表达的灰度分析。(a与相应的OGD 0 h组比较P<0.05，b与空白组相应的OGD 时间比较P<0.05，n≥3/组)

图1 ActA/Smads信号负性调控JNK磷酸化活化

(A)JNK1总蛋白及磷酸化蛋白表达检测；(B)JNK1总蛋白及磷酸化蛋白表达的灰度分析(a与对照组比较P<0.05，b与DMSO组比较P<0.05，n≥3/组)；(C)Smad3总蛋白及磷酸化蛋白表达检测；(D)Smad3总蛋白及磷酸化蛋白表达的灰度分析。(a与OGD0 h组比较P<0.05，b与DMSO组相应OGD时间比较P<0.05，n≥3/组)Smads通路发挥内源性神经保护作用。由缺血缺氧性损伤介导高表达的ActA，经跨膜信号转导磷酸化活化细胞内的Smad2/3。磷酸化的Smad2/3再与Smad4形成异二聚体转入细胞核，调控下游靶基因的表达[12,13]。这样，磷酸化的Smad2或Smad3的表达水平可一定程度上评估ActA/Smads信号的活化强度。然而，ActA/Smads信号的神经保护作用持续时间较短，活化强度有限[14]。事实上，ActA/Smads信号产生的生物学效能并不单单只是下游Smads信号的级联反应结果，它还受多种信号通路、细胞因子，从配体、到受体、再到Smads磷酸化等多位点的综合调控[15]。靶向这些位点的作用机制研究，将为延长ActA内源性神经保护作用时程，扩大作用强度，提升内源性神经保护效力提供潜在的干预位点。

图2 抑制JNK活化上调Act A/Smads通路活性

前期研究发现，JNK作为MAPK家族的成员之一，在缺血性脑卒中和神经系统退行性疾病中具有促进神经细胞凋亡的作用[16]。JNK1作为其主要的亚基，在脑组织中高表达。磷酸化激活的JNK1可进一步磷酸化活化下游的c-Jun[17]。体内外实验发现，磷酸化的c-Jun进入细胞核与DNA结合，通过调控靶基因转录进一步促进细胞死亡[17]。上述研究提示JNK信号具有促进细胞凋亡的作用。最近研究发现JNK与Smads信号存在交叉对话，急性肝损伤后JNK参与了TGF-β介导的Smad2/3信号的磷酸化活化[18]。但在缺血性脑损伤中JNK与ActA介导的Smads信号之间的相互作用仍不清楚。

为探讨该问题，本研究利用神经元样PC12细胞氧糖剥夺OGD模型，体外模拟脑神经细胞缺血缺氧性损伤。结果发现，OGD1h后JNK1总蛋白及磷酸化蛋白表达升高，提示缺血缺氧性损伤可早期激活JNK信号(图1-A)。给与外源性ActA 后，JNK1磷酸化水平显著降低，Smad3磷酸化水平升高，提示由外源性ActA介导的ActA/Smads信号活化，对JNK1信号具有负性调控作用。进一步，通过使用JNK化学抑制剂SP600125，竞争ATP结合位点，有效抑制JNK1磷酸化后，Smad3的磷酸化水平升高。说明JNK信号的磷酸化激活对ActA/Smads信号具有负性调控作用。总结以上研究结果，一方面，JNK信号随OGD损伤早期激活，负性调控ActA/Smads信号下游Smads位点磷酸化活化。另一方面，由OGD损伤介导的ActA表达上调及ActA/Smads信号激活[7]，又对JNK信号的活化起到抑制作用。JNK与ActA/Smads信号的这种交互作用，使得JNK成为ActA/Smads信号调控的一个有效潜在位点。通过下调脑缺血性损伤后JNK信号的活化，我们可以有效上调ActA/Smads通路的磷酸化激活水平，从而进一步抑制损伤介导的JNK内源性激活，实现对ActA/Smads信号的正性调控作用。上述信号调控机制的研究有望通过提高ActA信号的活化水平，为扩大内源性神经保护在缺血性脑卒中的应用提供前期实验基础。