miR-146a在系统性红斑狼疮患者血清中表达及意义

张 凡，曹峰林，李俊儒，孙国勋*

(1.哈尔滨医科大学附属第四医院 血液风湿科,黑龙江 哈尔滨150001; 2.哈尔滨医科大学附属第一医院 血液科,黑龙江 哈尔滨150001)

系统性红斑狼疮是常见的慢性、系统性的自身免疫性疾病。特征是产生自身抗体，形成免疫复合物沉积于组织器官形成炎症反应，导致多器官组织损伤，包括皮肤、肾脏、中枢神经系统、心血管系统、血液系统、肺脏、骨骼肌和胃肠道系统的紊乱，是影响人类健康的重要风湿病之一。因此，正确诊断非常重要。但直到目前为止，该病的诊断仍无标准，临床只能根据分类标准进行诊断。另外，早期诊断和早期治疗对系统性红斑狼疮的预后极其重要[1-3]。

MicroRNA(miRNA)是真核生物中一类长度19至25个核苷酸组成的RNA，它是由60至110个核苷酸组成的前体miRNA经Dicer酶加工而来。miRNA通过碱基配对与靶mRNA序列的3’UTR区域结合，抑制mRNA的转录，调控基因的表达，参与细胞分化、细胞增殖、细胞之间的相互作用及细胞信号通路的调节[4]。miRNA还参与多种疾病的发生和发展，包括心血管疾病、自身免疫性疾病、肿瘤等[5]。近年研究表明，miRNA在系统性红斑狼疮的发病过程中发挥重要作用[6]。血清中的miRNA性质稳定，目前已经在恶性肿瘤、心血管疾病、代谢性疾病等多种疾病中发现有特异的表达谱，可以用于这些疾病的诊断[7,8]。

本研究应用实时定量PCR(Q-RT-PCR)检测SLE患者血清中miR-146a的表达，与健康对照组相比，SLE患者血清中miR-146a明显降低。分析表明，SLE患者血清中miR-146a表达与患者血沉和C反应蛋白呈负相关，与补体水平呈正相关。这些结果提示血清中miR-146a不仅可以用于SLE的诊断，而且还可能与疾病活动相关。

1 材料和方法

1.1 研究对象

SLE患者22例。符合1997年美国风湿学会(ARA)修订的分类标准，均为女性，年龄为22-58岁。正常对照组20例，均为来自健康体检女性，年龄22-58岁，组间性别和年龄差异无统计学意义。

1.2 miRNA的提取和纯化

用mirVanaPARIS Kit(美国Ambion公司)提取和纯化miRNA，血清500 μl室温下加入1倍体积的denaturing solution，充分混匀，加入1 ml酚氯仿，涡旋震荡30-60 s， 14 000 r/min离心5 min，取上清液，加入 1.25倍体积的无水乙醇,充分混匀，将混合液加入到柱子中，12 000 r/min离心30 s，弃滤液，柱中加入700 μl wash solution 1，12 000 r/min离心30 s，弃滤液，柱中加入500 μl wash solution 2/3，12 000 r/min离心30 s，弃滤液，重复500 μl wash solution 2/3，12000 r/min离心30 s，弃滤液，12 000 r/min离心1 min，加 60 μl 95℃预热的elution solution到柱中，12000 r/min离心1 min，收集 miRNA。紫外分光光度仪检测 miRNA浓度和质量，-80℃冰箱冻存。

1.3 cDNA的合成

用TaqManTMMicroRNA Reverse Transcription Kit (美国ABI公司)将提取的miRNA逆转录成 cDNA，按说明书将5 μl miRNA加入反应体系中：16℃30 min，42℃30 min，85℃5 min；U6逆转录的反应条件：37℃30 min，85℃5 min，逆转录产物保持在-20℃备用。

1.4 Q-RT-PCR

取1 μl逆转录产物，用TaqManTMUniversal PCR Master Mix(美国ABI公司)进行Q-RT-PCR。反应体系20 μl，含逆转录产物1 μl,2×Master mix10 μl，PCRprimer0.5 μl，20×SYBRIlμl,H2O7.5 μl。反应条件：95℃10 min，然后95℃15 s，60℃1 min 40个循环。在 ABI7300型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)上进行实时荧光定量PCR。U6作为内参，结果计算用2-△CT方法，引物序列见表1。

表1 miR-146a和U6引物序列

1.5 统计学方法

采用 SPSS13.0软件包进行数据统计分析，患者与健康对照组进行t检验，用Pearson相关系数分析血清中miR-146a相对表达水平变量与红细胞沉降率(ESR)、C反应蛋白(CRP)和补体变量之间的相关性。P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清中miR-146a的相对表达水平

与健康对照组相比较，SLE患者血清中miR-146a相对表达水平降低(P=0.024),如图1所示。

2.2 SLE患者血清中miR-146a表达水平与ESR、CRP、补体C3和补体C4的相关性

SLE患者血清中miR-146a表达水平与ESR呈负相关(r=-0.464，P=0.030)，与CRP呈负相关 (r=-0.525，P=0.012)，见图2。SLE患者血清中miR-146a表达水平与补体C3呈正相关(r=0.487，P=0.021)，与补体C4呈正相关(r=0.580，P=0.005)，见图3。

图1 SLE患者血清miR-146a相对表达水平的变化

图2 SLE患者血清miR-146a表达水平与血沉和C反应蛋白相关性分析

图3 SLE患者血清miR-146a表达水平与补体C3和补体C4相关性分析

2.3 血清中miR-146a诊断SLE的性能

血清miR-146a诊断SLE的ROC曲线下面积为0.691(P=0.034)，诊断敏感度为63.64%，特异度为75%，见图4。

图4 ROC曲线下面积

3 讨论

SLE是一种自身免疫性疾病，发病机制尚不清楚。由于SLE缺乏特异性临床表现，因此早期诊断较为困难，常出现漏诊或误诊[1]。糖皮质激素是治疗SLE最常用药物，但部分患者病情不能得到有效控制。此外，糖皮质激素有严重的副作用。因此，发现SLE的生物标志物和治疗靶点具有重要的临床意义。

miRNA是一类包含19-25个核苷酸的单链非编码小RNA分子。通过转录水平调控基因表达，参与细胞增殖、凋亡、分化、代谢、死亡等生物过程。miRNA的转录改变在人体生理病理过程中发挥重要作用，影响靶基因的表达[9]。一些研究发现SLE患者血浆、PBMC、和特定细胞中miRNA表达异常[10]。多项研究发现SLE患者外周血单个核细胞(PBMC)中miR-146a表达降低[11-13]，Wang等研究发现，SLE患者血清中miR-146a表达降低，并且与患者C反应蛋白相关[14]，而尹志华等研究发现，SLE患者血清中miR-146a的表达水平有下降趋势，但无统计学意义[15]。本研究结果显示，SLE患者血清中miR-146a表达明显低于健康对照组。此外，miR-146a表达的降低与患者血沉和C反应蛋白呈正相关，与补体水平呈负相关,血清miR-146a ROC曲线下面积为0.691，诊断敏感度为63.64%，特异度为75%,表明miR-146a不仅与SLE的活动相关，还可以作为标志物用于SLE的诊断。

选择血清作为标本，操作方便，患者更容易接受。miRNA在血清中的相对表达可以反映SLE的变化，可以持续监测。