新型银包铜纳米线的制备及在检测罗非鱼中孔雀石绿残留中的应用

张梓涵,赵志慧,张苑怡,樊玉霞,2,赖克强,2,*

(1.上海海洋大学食品学院,上海 201306;2.上海海洋大学食品热加工工程技术研究中心,上海 201306)

孔雀石绿(Malachite green,MG),又名碱性绿,是一种人工合成的三苯甲烷类工业染料,因其能抑制水生生物疾病而被广泛应用于水产养殖业[1]。孔雀石绿在生物体中的代谢产物对人体有致畸、致癌、致突变的危害[2],我国已于2002年将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》,但因孔雀石绿成本低廉、药效显著,仍被不少养殖户违法使用,导致水产品孔雀石绿安全事件层出不穷[3]。目前常用的孔雀石绿检测方法有高效液相色谱法[4]、气相色谱-质谱联用法[5]和液相色谱-质谱联用法[6]。这些方法因前处理复杂、检测时间长、对操作人员要求高,而在现场快速检测中受限。

表面增强拉曼光谱(surface enhanced Raman spectroscopy,SERS)是一种高灵敏度的分析技术,通过贵重金属纳米材料的局域表面等离子体共振,使被分析粒子表面产生强电磁场增强,实现对目标物的超灵敏检测[7]。SERS具有检测时间短、专一性高、灵敏度好的优点,近年来已被广泛应用牛奶中的三聚氰胺[8]、鱼肉中的组胺[9]、鸡尾酒中的色素添加[10]等食品中化学危害物残留的检测。基底的选择是SERS技术应用中的关键环节之一,目前常用的基底为金、银及其溶胶[11-13],这些基底增强效果好,但价格较为昂贵。因此如何降低基底的成本,又能保证其增强效果已成为SERS领域的研究热点之一。

相对于单一金属,核壳纳米结构具有更好的增强能力和催化活性[14],生产过程中减少了金、银等贵金属的用量,降低了成本,具有很高的实际应用价值。双金属核壳纳米结构一般为较便宜的金属外部包裹贵重金属薄膜,制成核壳纳米结构,近年来已成为研究人员的研究热点。如Ye等[15]研究了铜纳米线的生长过程,阐述了在其表面分别镀上Ni、Au、Ag等多种金属薄膜的方法,并探讨了核壳结构作为太阳能电池和有机发光二极管的应用,结果表明,银膜包裹的铜纳米线所需后续处理最少就能达到与银纳米线相同的光电性质;Jin等[16]通过简单的化学还原法合成了球型银包铜纳米粒子,并将其作为SERS基底对结晶紫标准品进行分析,结果显示,该球型银包铜纳米粒子平均SERS增强因子约为104。目前关于银包铜纳米线作为SERS增强基底应用于孔雀石绿检测未见报道。

本研究制备了新型具有核壳结构的银包铜纳米线,将其应用于罗非鱼中孔雀石绿残留的检测,通过建立PLS数学模型对检测结果进行定量分析,探讨基底增强效果的稳定性,以期获得增强因子高且成本较低的新型双金属核壳纳米SERS基底。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

罗非鱼鱼肉 高要振业水产有限公司;氢氧化钠、50%水合肼溶液、三水合硝酸铜、二甘醇、二氯甲烷、盐酸羟胺、中性氧化铝、对甲苯磺酸 分析纯,国药集团化学试剂有限公司;聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、乙腈(色谱纯) 百灵威科技有限公司;L-抗坏血酸 分析纯,阿法埃莎(中国)化学有限公司;乙二胺(EDA)、N,N-二乙基羟胺(DEHA)、35%水合肼溶液、硝酸银、孔雀石绿(MG) Sigma-Aldrich公司。

中性氧化铝固相萃取柱(1 g,3 mL)、丙磺酸固相萃取柱(PRS-SPE,500 mg,3 mL) Supelco公司;DXR显微共聚焦拉曼光谱仪 美国Thermo Fisher Scientific公司;UV3000PC型紫外-可见分光光度计(UV-vis) 美谱达仪器有限公司;JEM-2100F型场发射透射电子显微镜(TEM) 日本JEOL公司;磁力搅拌器(PC-420D) 美国Corning公司。

1.2 实验方法

1.2.1 银包铜纳米线(Cu-Ag NWs)的合成 通过两步化学还原反应制得Cu-Ag NWs[16]。

1.2.1.1 铜纳米线(CuNWs)的合成 取40 mL 15 mol/L的氢氧化钠溶液于圆底烧瓶中,依次加入2 mL硝酸铜溶液(CuNO3,0.1 mol/L)、300 μL乙二胺溶液、50 μL水合肼溶液(35% wt)。轻轻振荡摇匀后,置于80 ℃水浴中反应1 h,即得CuNWs。反应得到的CuNWs用无水乙醇和1% PVP和3%水合肼的混合液洗涤数次,分散在1% PVP和3% DEHA的混合液中。4 ℃冰箱贮存待用。

1.2.1.2 银壳的生长 取0.5 mL 1.2.2.1中制得的CuNWs分散液,加入1.2 mL的L-抗坏血酸溶液(0.1 mol/L),混匀后逐滴加入2.7 mL AgNO3溶液(1 mmol/L),持续反应5 min后即得银包铜纳米线。将反应液涡旋振荡,4500 r/min离心5 min后,除去上清液,加入无水乙醇洗涤,涡旋振荡,4500 r/min离心5 min后除去上清液,重复三次,以除去溶液中残留的L-抗坏血酸和PVP。所得银包铜纳米线(Cu-Ag NWs)4 ℃储存待用。

1.2.2 Cu-Ag NWs的表征

1.2.2.1 紫外光谱表扫描 分别取一定量的1.2.1中制得的CuNWs和Cu-Ag NWs于两支洁净试管中,加入超纯水稀释后,用紫外-可见分光光度计(UV-vis)分别测定稀释液吸光度。光谱扫描范围:200～800 nm。

1.2.2.2 透射电镜扫描 用发射透射电子显微镜(TEM)对所制得的Cu-Ag NWs进行透射电镜扫描。最高加速电压为200 kV,分辨率可达0.2 nm。

1.2.3 孔雀石绿标准溶液的配制 将孔雀石绿标准品配制成100 mg/L的标准储备液,密封后置于-20 ℃避光保存。取一定量标准溶液用50%的乙腈水溶液稀释成0.5、1.0、3.0、5.0、20.0 ng/mL系列浓度的标准工作液,4 ℃避光保存。

1.2.4 罗非鱼肉中孔雀石绿的检测

1.2.4.1 鱼肉样品前处理 参考美国FDA标准提取罗非鱼中的孔雀石绿[17]。方法如下:取一定量罗非鱼肉高速均质5 min,将均质后的样品充分混合。称取5 g均质后的鱼肉样品,依次加入pH为4.5的乙酸铵缓冲液(5 mL,0.1 mol/L)、盐酸羟胺溶液(1 mL,0.25 g/mL)、对甲苯磺酸溶液(100 μL,1.0 mol/L),充分振荡混合后加入25 mL乙腈,混匀后加入10 g中性氧化铝,充分振荡混匀后4000 r/min离心5 min。离心后将上清液转移至装有50 mL水和2 mL二甘醇的分液漏斗中,下层沉淀物用25 mL乙腈重复提取1次,合并上清液至分液漏斗中。

1.2.4.2 净化 向分液漏斗中加入25 mL二氯甲烷,反复颠倒几次混合均匀,液-液萃取分离10 min。分层后将下层溶液转移至圆底烧瓶中,再向分液漏斗中加入25 mL二氯甲烷重复提取1次,将二氯甲烷层合并收集在同一圆底烧瓶中,50 ℃旋转蒸干,将得到的残渣溶解于3 mL乙腈。将用5 mL甲醇和5 mL乙腈活化过的中性氧化铝固相萃取小柱和PRS小柱串联,加入样液。将盛放过样液的圆底烧瓶用乙腈反复洗涤2次,每次用5 mL乙腈。一段时间后弃去中性氧化铝小柱,在PRS小柱加入5 mL乙腈后再加入4 mL乙酸铵和乙腈的等体积混合液洗脱,洗脱后加入乙酸铵和乙腈的等体积混合液定容至5 mL,得到罗非鱼鱼肉基质液,备用。

1.2.5 SERS检测条件 使用本实验室之前所用方法[18],取孔雀石绿标准品粉末1.0 g于干净玻璃片上,进行SERS测试,得到孔雀石绿固体SERS光谱图;取50 μL的Cu-Ag NWs与50 μL 1.2.3所制得标准溶液(或1.2.4所得基质液)混合均匀后,移取5 μL滴在干净的玻璃片上,50 ℃下干燥1～2 min至玻璃片表面液体蒸干后,进行SERS测试,分别得到孔雀石绿标准液(图4)和基质液(图5)的SERS光谱。

光谱采集条件为:633 nm激光源,20倍物镜,激光源功率6 mW,曝光次数为10次,每次曝光时间为2 s。每个样品在基底上随机采集10条光谱,在不同批次的基底上重复采集3次,共获得30条光谱,取其平均谱图进行分析。

1.3 数据处理

采用Delight软件对光谱进行平滑处理,改善谱峰重叠情况后建立偏最小二乘(Partial Least Squares,PLS)定量预测模型。通过模型的预测值和真实值之间的决定系数(coeffificients of determination,R2)以及样品实际浓度的标准偏差与预测误差的标准偏差之间的比值(ratio of sample standard deviation to standard error of prediction,RPD)和均方根误差(root mean square error,RMSE)判断模型的预测能力,R2、RPD越大,RMSE越小,说明模型预测能力越好。

2 结果与分析

2.1 Cu-Ag NWS的表征

对制得的Cu-Ag NWS进行UV-Vis光谱扫描和透射电镜表征,结果如图1～图2所示。由图1a可知,Cu NWs的紫外吸收特征图谱只有221 nm处有明显的吸收峰,Cu-Ag NWs的特征峰位于265 nm处(图1b),初步判定铜纳米线上包裹上银膜,使特征吸收峰产生明显红移,且两条谱线半峰宽峰形均狭窄,表明胶体中粒子分散均匀。结合图2a可知,Cu-Ag NWs呈规则的线型,且纳米线长度在10 μm以内,外径为60～70 nm;图2b进一步表明,Cu NWs外围有一层均匀的银壳,壳层厚度约为12 nm。由图2b观察可知,银包铜纳米线表面局部有小颗粒存在,可能为离心过程未彻底除去的溶液中聚集的银颗粒。

图1 紫外可见吸收图谱

图2 银包铜纳米线的透射电镜图

2.2 孔雀石绿固体拉曼图谱分析

孔雀石绿分子结构式及其常规拉曼光谱图如图3所示,谱图中对应的主要特征峰的归属情况见表1。其中436 cm-1处特征峰由平面外苯基-C-苯基振动引起;796 cm-1处特征峰由平面外环上C-H振动引起;1174 cm-1处特征峰由面内环上C-H弯曲振动引起;1364、1615 cm-1处特征峰则分别对应N-苯基伸缩振动、环上C-C伸缩振动[19]。

图3 孔雀石绿分子式及固体拉曼图谱

表1 孔雀石绿常规拉曼峰归属

2.3 孔雀石绿标准溶液的SERS检测

不同浓度的孔雀石绿标准溶液的SERS图谱如4所示。由图4可知,不同浓度的孔雀石绿标准溶液SERS谱图与其常规固体拉曼谱图总体上是一致的,特征峰发生一定程度的红移,其中1174、1364、1615 cm-1处的特征峰分别红移至1176、1371、1618 cm-1处。使用此银包铜纳米线作为基底没有对孔雀石绿的特征信号造成影响,未出现杂峰或特征峰的较大偏移,这可能与孔雀石绿分子吸附在Cu-Ag NWs基底上的位置或方向存在差异及分子振动类型不同有关[20]。因此,此银包铜基底可用于溶液体系中孔雀石绿的测定。

图4 孔雀石绿标准溶液SERS图谱

由图4可知,特征峰强度随孔雀石绿浓度从0增加到20 μg/kg而呈规律性的增强。当孔雀石绿标准溶液浓度低至0.5 μg/kg时,其主要拉曼特征峰依然清晰可辨。利用二阶导数变换可以分离重叠峰,消除基线漂移,提高光谱分辨率,如图5二阶导数图谱(及1550～1600 cm-1局部放大图)所示,经二阶导数变换,可清晰观察到浓度为0和0.5 μg/kg的孔雀石绿拉曼图谱。由SERS图谱及二阶导数图谱可知,特征峰强度随孔雀石绿标准溶液浓度增大而增强,峰强度与浓度之间可能存在着较好的线性关系。为此采用偏最小二乘法建立模型,确立实际浓度和预测浓度之间的关系。如图6所示,PLS模型结果为:R2=0.967、RPD=5.897、RMSE=1.077,显示实际浓度与预测浓度具有良好的线性相关性,这种良好的线性关系可以归结为SERS基底上增强热点的均匀分布,若增强热点在基底上分布不均匀,可能导致目标分析物拉曼信号发生较大变化,从而使被分析物难以量化[20]。

图5 孔雀石绿标准溶液二阶导数图谱

图6 PLS模型

2.4 罗非鱼肉中孔雀石绿残留检测

鱼肉是一种复杂的食品基质,其中的蛋白质、脂肪、色素等化学成分可能对目标化合物的分析检测造成一定的影响或干扰[21],利用Cu-Ag NWs作为SERS基底进一步对罗非鱼中孔雀石绿提取液进行检测。如图7所示,可见鱼肉样品经过前处理后已较为纯净,但仍有少量杂质残存对其SERS检测产生了影响,所得谱图与孔雀石绿标准溶液SERS图谱相比相差不大,特征峰在1177 cm-1处发生了轻微红移,1373和1619 cm-1处发生了轻微红移。与孔雀石绿固体拉曼图谱相比,鱼肉中孔雀石绿提取液的SERS图谱主要特征峰强度变化较小,但整体发生了明显的红移,其中几处谱峰红移明显。具体谱峰变化如下:孔雀石绿固体拉曼图谱中1174 cm-1红移至1177 cm-1;1364 cm-1处红移至1373cm-1;1615 cm-1处红移至1619 cm-1。

图7 罗非鱼中孔雀石绿SERS图谱

由图8观察到特征峰强度与孔雀石绿浓度间呈良好的相关性,图8为796,436,1177,1619 cm-1处特征峰强度与1～10 μg/kg浓度的对应关系。结果表明,孔雀石绿浓度与特征峰强度呈良好的线性关系,回归直线方程分别为y=443.85x+447.83,y=620.19x+732.22,y=838.23x+775.96,y=1083.8x+1087.1(x为孔雀石绿浓度,y为特征峰强度);R2分别为0.9738,0.9467,0.9751,0.9692。进一步结合化学计量法建立PLS模型对鱼肉样品中的孔雀石绿残留进行定量分析,如图9所示,PLS模型显示了较好的预测能力,其R2为0.95,RPD为6.171,RMSE为0.595。表明此方法对于水产品中孔雀石绿残留的定量分析与检测具有巨大潜力。

图8 拉曼位移为436,796,1177,1619 cm-1处的特征峰强度与孔雀石绿浓度的关系图

图9 PLS模型

为探究此方法检测孔雀石绿的最低检测浓度,在孔雀石绿浓度为0～1.0 μg/kg范围内设置浓度梯度。图10A为孔雀石绿标准溶液浓度分别为0、0.3、0.5 μg/kg时的SERS图谱,可见当孔雀石绿浓度为0.5 μg/kg时,特征峰已清晰可见;图10B为鱼肉基质液中孔雀石绿浓度分别为0.5、0.7、1.0 μg/kg时的SERS图谱,由图可知,当孔雀石绿浓度为0.7 μg/kg时,可观察到1177、1373、1619 cm-1处的特征峰,当浓度升高至1.0 μg/kg时,特征峰清晰可见。鱼肉基质中含有的复杂组分对SERS检测结果产生影响,导致鱼肉基质液中孔雀石绿最低可检测浓度(1.0 μg/kg)高于孔雀石绿标准溶液最低检测浓度(0.5 μg/kg)。

图10 孔雀石绿标准溶液及鱼肉基质液中孔雀石绿SERS图谱

3 结论

以乙二胺还原法制备的铜纳米线为种子,再利用L-抗坏血酸还原法在铜纳米线表面镀上一层银壳,成功制备出Cu-Ag NWs,将其应用于罗非鱼中孔雀石绿残留的检测。结果表明,PLS模型中R2均大于0.95,RPD接近于6,模型显示很好的预测能力。罗非鱼基质液中孔雀石绿浓度与特征峰强度呈良好的线性关系,回归直线方程的R2分别为0.9738,0.9467,0.9751,0.9692。基底对孔雀石绿标准溶液和罗非鱼中孔雀石绿提取液的最低检出浓度分别为0.5、1.0 μg/kg,我国针对水产品中孔雀石绿的现行标准(GB/T 19857-2005)采用高效液相色谱法和液相色谱-串联质谱法,检出限分别为2.0 μg/kg、0.5 μg/kg,该方法的检出限基本满足检测要求,但此方法操作步骤简化、检测时间大大缩短,更容易满足实际样品的快速检测需求。