QuEChERS液质联用法测定禽源性食品中苯基吡唑类杀虫剂残留

周 佳,苏阿龙,朱书强,王丽君,禹 洁

(甘肃省食品检验研究院,甘肃兰州 730000)

苯基吡唑类杀虫剂是一类吡唑环上取代位和取代基多的化合物,由于其活性强,市场化的吡唑类化合物非常多[1],其中最常见的苯基吡唑类杀虫剂就是氟虫腈及其代谢物、氟虫腈的类似物。氟虫腈能够杀灭跳蚤、虱子、蜱虫、蟑螂、螨虫等[2-4]。而且氟虫腈在施用后会产生毒性更强的代谢物:氟虫腈砜、氟虫腈亚砜和氟甲腈[5-8]。氟虫腈及其代谢物的危害主要在于人体摄入后会影响神经系统并且会损伤肝脏、甲状腺等[5,9]。2017年爆发于欧洲的鲜蛋氟虫腈事件严重影响鲜蛋行业有序发展[10]。其实,欧盟早已禁止氟虫腈在食品产业畜禽养殖中使用,中华人民共和国农业部在2009年也已发布公告明确了氟虫腈的使用范围[9，11],GB 2763-2016中对于氟虫腈的允许使用范围及限量也有明确要求,氟虫腈在禽源性食品中是不得检出。自此行业研发人员开启了同等效用氟虫腈类似物的研究序幕。由于氟虫腈类似物的化学结构与氟虫腈类似,该类物质也可以达到杀灭跳蚤、虱子、蜱虫、蟑螂、螨虫等的作用,目前已市场化的产品就是乙虫腈和丁烯氟虫腈。德国拜耳公司开发的乙虫腈是氟虫腈的乙基类似物,它的活性比氟虫腈高,易合成。乙虫腈是通过破坏中枢神经系统正常活动致死昆虫[12-13]。丁烯氟虫腈也是在氟虫腈基础上开发出来的新型杀虫剂,它具有高活性、光谱杀虫的特点[14]。丁烯氟虫腈对鳞翅目害虫具有与氟虫腈同等的活性,但是有研究表明丁烯氟虫腈在环境中有移动性而且代谢时间长[15]。综上,建立同时检测上述6种苯基吡唑类杀虫剂的快速方法非常必要。

根据相关文献报道及标准,氟虫腈及其代谢物的检测方法主要有气相色谱-质谱联用法(Gas Chromatography-mass Spectrometer)GC-MS[16-20]、高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography)LC[21]、液相色谱-质谱联用法(Liquid Chromatography-mass Spectrometer)LC-MS[22]、气相色谱法(Gas Chromatography)GC[23-24]、等。乙虫腈的检测方法有LC[25]、GC[23-24]、LC-MS[13]等。丁烯氟虫腈的检测方法有GC[26-27]、GC-MS[28]、LC-MS[29-30]等。这些检测方法大都步骤复杂、成本高、耗时长、损失大,研究内容均为氟虫腈及其代谢物在各种不同基质中的检测,并无同时检测多种苯基吡唑类杀虫剂的方法研究,针对禽源性食品中苯基吡唑类杀虫剂的研究报道更是空白。

综上,本方法采用乙腈提取,QuEChERS方法净化,基于UHPLC-MS/MS的MRM模式,对禽源性食品中6种苯基吡唑类杀虫剂残留的分析方法进行研究,以期达到比传统方法步骤更简单、回收率更稳定、参数更优化、适用范围更广的效果,同时达到填补苯基吡唑类杀虫剂在禽源性食品中检测方法的空白,为相关单位制定风险监测方案及市场监管提供参考的目的。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

禽蛋、禽肉、禽内脏 均来自于甘肃各地州市农贸市场;氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜、乙虫腈(标准品) 纯度>98%,德国Dr.公司;丁烯氟虫腈(标准品) 大连瑞泽农药股份有限公司;乙腈(色谱纯) 德国MERCK;乙酸铵、甲酸(色谱纯) 美国Fisher公司;N-丙基乙二胺(primary secondary amine)PSA、十八烷基硅胶C18上海安谱实验科技有限公司;其他试剂 均为国产分析纯。

QTRAP 5500三重四级杆液相-质谱联用仪(配有电喷雾离子源(ESI)及Analyst®数据处理系统) 美国AB公司;Vortex 3型涡旋振荡器 德国IKA公司;Avanti J-25落地式高速冷冻离心机 美国BECKMAN公司;纯水机 美国thermo公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备 禽蛋类样品:取内容物打散后,用均质机充分均质,分装入洁净的容器密封,-20 ℃保存;禽肉及禽内脏类样品:分解切碎后,用均质机充分均质,分装入洁净的容器密封,-20 ℃保存。

1.2.2 样品前处理 禽蛋类样品:准确称取2 g待测样品于50 mL离心管中,加入乙腈10 mL,摇匀后超声提取15 min;加入4 g无水硫酸镁、1 g氯化钠、50 mg C18,涡旋2 min,10000 r/min离心(4 ℃)5 min。移取0.55 mL乙腈层,加入0.45 mL水,涡旋1 min,经0.22 μm有机滤膜过滤,待测。

禽肉及禽内脏类样品:准确称取2 g待测样品于50 mL离心管中,加入5 mL水涡旋分散,加入乙腈10 mL,以下操作同“禽蛋类样品”。

1.2.3 标准溶液配制 准确称取标准品氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜、乙虫腈0.01 g(精确至0.0001 g),于10 mL棕色容量瓶中,用乙腈溶解定容,配制成单一的标准储备溶液(1000 μg/mL),于-20 ℃下保存。按照各化合物的响应不同选择线性范围,配制6种苯基吡唑类杀虫剂的标准混合使用液。准确吸取适量标准混合使用液于10 mL棕色容量瓶中,用55%乙腈水定容即得混合标准溶液系列,2～8 ℃保存7 d。

1.2.4 色谱条件 色谱柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18Column(规格100 mm×2.1 mm,粒径1.7 μm);流速0.3 mL/min;柱温35 ℃;流动相:A(乙腈)+B(水);梯度洗脱条件:0～3.0 min 55%～70% A,3.0～3.5 min 70%～98% A,3.5～5.0 min 98% A,5.0～5.5 min 98%～55% A,5.5～8.0 min 55% A。进样量5 μL。

1.2.5 质谱条件 离子源:Electron Spray Ionization(ESI);离子化电压:-4500 V;辅助加热气压力:55 psi;喷雾气压力:50 psi;辅助加热气温度:550 ℃;动态多反应监测(MRM)模式;负离子扫描;6种苯基吡唑类杀虫剂的色谱质谱参数详见表1。

表1 苯基吡唑类杀虫剂色谱质谱参数

1.2.6 检出限和定量限 按照各目标物的响应分别计算信噪比S/N，以3倍信噪比(S/N=3)计算各目标物的检出限(LOD)，以10倍信噪比计算各目标物的定量限(LOQ)。

1.2.7 加标回收率试验和精密度试验 参考六种苯基吡唑类杀虫剂的定量限，对各目标物选择3种不同浓度进行加标回收率验，按照1.2.2进行样品提取并按照1.2.4和1.2.5的色谱质谱条件分别进样，每个样品平行进样5次，计算回收率和RSD。

1.3 数据处理

将获得的数据文件导入AB Sciex MultiQuantTM软件进行数据处理,以各目标物的保留时间作为筛查依据,以离子峰度比作为确证依据，进行定性判断；同时绘制基质标准曲线对样品中的各目标物进行定量。

2 结果与分析

2.1 净化材料优化

针对不同材料的吸附特性(比如,PSA用于吸附杂质中的碳水化合物、脂肪酸、有机酸、酚类和少量的色素;C18用于吸附脂肪和酯类等非极性化合物),结合样品中杂质的性质,本方法选用C18、C18+PSA对禽源性样品进行净化,同时考察净化材料对目标物的吸附情况。样品按照1.2.2处理,氟虫腈及其代谢物、乙虫腈、丁烯氟虫腈的添加水平分别为0.10、1.00、2.00 μg/kg,采用基质标准曲线定量。结果显示,采用单独C18净化,6种苯基吡唑类杀虫剂的回收率在89.6%～117.4%范围内,RSD为1.8%～4.7%;采用C18+PSA混合净化,6种苯基吡唑类杀虫剂的回收率在88.6%～113.1%范围内,RSD为2.0%～5.5%。综上,选择C18作为样品前处理的净化材料。进而考察C18的添加量,当样品量为2 g,C18添加量为50 mg时,谱图显示样品基质噪音降低明显,继续增大C18的添加量并没有明显的差别,所以选择50 mg作为前处理步骤中C18的添加量。

2.2 待测液溶剂对响应的影响

采用乙腈作为待测液溶剂,质谱分析后,目标物均出现峰展宽、分叉的现象(如图1A),这是由于纯乙腈的洗脱强度大于乙腈-水,使得目标物出峰变形并且柱效下降,即产生了溶剂效应。为了消除溶剂效应对于目标物响应的影响,本方法将乙腈更换为55%乙腈+45%水,由于该待测液溶剂与流动相相似,所以消除的溶剂效应,分析后6种苯基吡唑类杀虫剂的峰形有明显改善,峰形变得尖锐、窄(如图1B)。综上,本方法选用乙腈-水(55%+45%)作为待测液溶剂。

图1 溶剂对苯基吡唑类杀虫剂峰形的影响

2.3 流动相优化

考虑到流动相对目标物峰形、灵敏度的影响,本方法重点关注了流动相的选择。选择六种流动相进行考察:乙腈-水;甲醇-水;乙腈-5 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1%甲酸);甲醇-5 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1%甲酸);乙腈-5 mmol/L乙酸铵水溶液;甲醇-5 mmol/L乙酸铵水溶液。采用100 μg/L的混合标准溶液作为分析对象,各流动相体系下目标物的峰面积比较见表2。大部分苯基吡唑类杀虫剂在乙腈-水体系中响应高,氟虫腈砜在甲醇-水体系中响应较高。在甲醇体系中目标物均出现了峰变宽、分叉。在乙酸铵体系中,由于缓冲盐解离后偏酸性,抑制目标物离子化,导致目标物信号响应降低一倍左右。在甲酸酸化缓冲盐体系中,由于甲酸的酸性更强,抑制目标物离子化更明显,目标物的响应降低2～5倍。综上,选择乙腈-水作为流动相。

表2 不同流动相下苯基吡唑类杀虫剂的峰面积

2.4 MS/MS参数的优化

比较正、负离子扫描模式下6种苯基吡唑类杀虫剂的响应,选择适合6种苯基吡唑类杀虫剂的电离方式和分子离子峰。在ESI-模式下,6种苯基吡唑类杀虫剂的Q1扫描图中可以清晰的看到同位素峰的存在(图2),这是因为该类化合物的分子结构中均含有2个Cl原子(自然界中Cl以Cl-35和Cl-37两种形式存在)的原因。按照目标物响应高且容易获得(碰撞电压相对较低)的原则,各选择2个离子对作为定量、定性离子对。

图2 6种苯基吡唑类杀虫剂的Q1全扫描质谱图

例如氟甲腈,当去簇电压从0～-300 V变化时,首先由于目标物离子与溶剂分子形成的簇离子随着电压的增强而减少,目标物加和离子的响应是逐渐增强的;但是当电压超过某一个值之后,目标物加和离子的响应出现骤减,这是由于该目标离子的源内裂解造成的。最终选择-120 V作为氟甲腈的去簇电压。当碰撞电压从0～-200 V变化时,首先随着碰撞电压的增加,目标物加和离子化学键碎裂,目标子离子的响应增强,当电压超过某一个值时,目标子离子的响应出现明显的下降,这是由于电压太大将子离子进一步打碎的结果。最终选择-18 V作为387.0/351.0的碰撞电压,选择-45 V作为387.0/281.9的碰撞电压。详细数据见表1。

2.5 基质效应

在液相-质谱分析中,样品中除目标物之外的其他成分会对目标物的测定造成影响,即基质效应。基质效应按照其对目标物响应的影响分为基质增强效应和基质抑制效应。本实验参考Gosetti等[31]的方法考察了基质效应,采用三种类型的样品按照1.2.2前处理,用得到的空白基质溶液分别配制三条基质标准曲线,同时用初始流动相配制溶液标准曲线。计算方法如下:

X(基质效应)=(标准曲线斜率-基质加标曲线斜率)×100/标准曲线斜率。

由表3可知,6种苯基吡唑类杀虫剂的X<1%,即6种苯基吡唑类杀虫剂均表现为基质抑制效应。综上,采用基质标准曲线法进行定量。

表3 苯基吡唑类杀虫剂的基质效应(%)

2.6 方法学验证

2.6.1 线性关系与定量限 氟虫腈及其代谢物的基质标准曲线线性范围为1～40 μg/kg,决定系数(R2)>0.9980;丁烯氟虫腈的基质标准曲线线性范围为10～400 μg/kg,决定系数(R2)>0.9940;乙虫腈的基质标准曲线的线性范围为4～160 μg/kg,决定系数(R2)>0.9980。以3倍信噪比(S/N=3)计算各目标物的检出限(LOD),以10倍信噪比计算各目标物的定量限(LOQ),6种苯基吡唑类杀虫剂的检出限为0.02～0.40 μg/kg,定量限为0.06～1.20 μg/kg。(见表4)

表4 苯基吡唑类杀虫剂的线性方程、相关系数、线性范围、检出限、定量限数据

由表4可知,在不同的畜禽样品中同一个杀虫剂的检出限与定量限会有轻微的差别,这是由于基质不同所引起的,但是均可以满足检测的需要。

2.6.2 回收率和精密度 本方法采用三类禽源性样品(禽蛋、禽肉、禽内脏)进行标准添加实验,向空白禽源性样品中添加不同水平的氟虫腈及其代谢物(1#为0.05 μg/kg、2#为0.50 μg/kg、3#为1.00 μg/kg)、丁烯氟虫腈(1#为1.00 μg/kg、2#为10.00 μg/kg、3#为20.00 μg/kg)和乙虫腈(1#为0.50 μg/kg、2#为5.00 μg/kg、3#为10.00 μg/kg)。按1.2.2步骤操作,6种苯基吡唑类杀虫剂的回收率在84.49%～107.86%范围内,RSD在0.99%～4.19%范围内。具体数据见表5。

表5 苯基吡唑类杀虫剂在不同添加水平下的回收率和相对标准偏差(%)

2.7 实际样品检测

采用本方法对禽蛋、禽内脏、禽肉进行实际样品测试,检出阳性样品3份。其中1份鲜蛋检出氟虫腈,1份鸡肉检出氟虫腈,1份鸡肝检出氟甲腈。氟虫腈阳性样品和10 ng/mL基质标准中6种苯基吡唑类杀虫剂的特征谱图见图3。由图3可知,A样品中保留时间与定性、定量离子均与氟虫腈的基质标准品相匹配,检出氟虫腈。

图3 鸡蛋阳性样品及氟虫腈标准品的提取离子流图

3 结论

本方法通过QuEChERS方法净化,ESI-negative-MRM质谱分析,建立了快速、高效、同时检测禽源性食品中6种苯基吡唑类杀虫剂的检测方法。6种苯基吡唑类杀虫剂的定量限范围在为0.06～1.20 μg/kg,在不同线性范围(1～40、4～160、10～400 μg/kg)下决定性良好(R2>0.994)。

针对6种苯基吡唑类杀虫剂分别进行三类样品基质的3水平标准添加测试,回收率达84.49%～107.86%,相对标准偏差为0.99%～4.19%。

QuEChERS方法净化操作简单,样品仅需简单提取、净化即可进行上机测试得出结果,前处理的经济成本与时间成本远远低于传统方法,具有非常好的推广应用价值。本方法在禽源性食品中得到了很好的应用,但对于植物源性食品的检测,还需确定其适用范围和条件进一步研究。该方法的建立相关单位制定风险监测方案及市场监管提供了参考。