荜茇酰胺对KRAS突变肺腺癌细胞增殖和凋亡的影响研究

叶武 钦光跃 唐婷玉 杜坚宗 刘娟 黎雪芳

肺腺癌是肺癌常见的组织学类型。肺腺癌患者Kirsten鼠肉瘤病毒癌基因（KRAS）突变的检出率接近30%[1]，然而目前尚无直接靶向KRAS突变的有效药物[2-3]。因此，临床迫切需要研究针对KRAS突变的治疗方案。荜茇酰胺属于生物碱类化合物，最初分离自胡椒科植物荜茇Piper longum Linn.的根，具有多种药理学作用，是一种极具潜力的中药单体[4]。2011年，Raj等[5]研究发现荜茇酰胺可选择性地抑制肿瘤细胞而不影响正常组织。基于此，本研究旨在探讨荜茇酰胺对KRAS突变肺腺癌细胞增殖和凋亡的影响，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 人肺腺癌KRAS突变细胞株A549购自上海中国科学院细胞库。荜茇酰胺为美国Selleck chemicals公司产品。无血清细胞冻存培养基RPMI 1640购自杭州基诺生物工程有限公司。CCK-8溶液购自上海七海复泰生物科技有限公司。膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）染色液和碘化丙啶（PI）染色液为美国BD公司产品。流式细胞仪购自美国BD公司。多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）抗体、B细胞淋巴瘤/白血病-2（BCL2）抗体均为美国CST公司产品，微管相关蛋白轻链3B（LC3B）抗体为美国Novus Biologicals公司产品，α-tubulin抗体为美国Sigma公司产品。化学发光荧光影像分析仪购自日本富士胶片公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 A549细胞在含10%FBS的RPMI 1640培养基中培养，置于37℃、5%CO2培养箱中备用。

1.2.2 细胞活力检测 采用CCK-8法。A549细胞培养至对数期，收集细胞，吸取适量体积的细胞悬液加入96孔板中（接种细胞数3 000个/孔），置入培养箱中培养。24h 后加入不同浓度梯度（0、1、5、8、10μmol/L）的荜茇酰胺，继续培养48h，每孔加入10μl CCK-8溶液，采用超微量分光光度计，测定在450nm处吸光度（OD值）。细胞活力（%）=[OD值（加药）-OD值（空白）] /[OD值（未加药）-OD值（空白）] ×100%。

1.2.3 细胞凋亡率检测 收集5～10万个A549细胞，1 000r/min 离心 5min，弃上清液，用 100μl的 1×Binding Buffer轻轻重悬细胞，转移至流式细胞仪的检测管。加入5μl Annexin V-FITC染色液和5μl PI染色液，轻轻混匀，室温避光孵育15min。采用流式细胞仪检测细胞凋亡率，细胞凋亡率=Annexin V-FITC阳性PI阴性细胞数/细胞总数×100%。实验重复3次。

1.2.4 细胞凋亡相关蛋白与自噬相关蛋白表达水平检测 采用Western blot法。使用蛋白提取试剂提取A549 细胞的总蛋白，采用 4，4′二羧酸-2，2′-喹啉（BCA）法进行蛋白定量。取各样本30～60μg蛋白质，变性后上样，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDSPAGE）电泳（具体根据所检测的蛋白分子量，调节电泳时间），切取合适大小的胶，转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，室温下封闭2h，加入细胞凋亡相关蛋白PARP、BCL2，自噬相关蛋白LC3B以及α-tubulin一抗，4℃孵育过夜。取出PVDF膜，漂洗3次，加入二抗封闭液，室温下孵育1.5h，滴加适量电化学发光（ECL）显色液，置入化学发光荧光影像分析仪曝光，采用Image J软件计算Western blot蛋白条带的灰度值，蛋白表达水平用相对灰度值表示，计算公式为：目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参条带灰度值。实验重复3次。

1.3 统计学处理 应用SPSS 20.0统计软件。计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度荜茇酰胺对A549细胞活力的影响 0、1、5、8、10μmol/L 的荜茇酰胺干预 A549 细胞后，细胞活力分别是 100%、（92.312±2.923）%、（62.034±3.712）%、（45.731±5.215）%、（22.021±8.533）%（P＜0.05），荜茇酰胺浓度越高，细胞活力越低（两两比较均P＜0.05）（图1），这说明荜茇酰胺可抑制KRAS突变肺腺癌细胞增殖。

图1 不同浓度荜茇酰胺对A549细胞活力的影响

2.2 不同浓度荜茇酰胺对A549细胞凋亡的影响0、1、5、10μmol/L荜茇酰胺干预A549细胞后，细胞凋亡率分别是（9.624±1.812）%、（14.945±0.321）%，（16.834±1.515）%、（27.416±5.741）%（P＜0.05），荜茇酰胺浓度越高，细胞凋亡率越高（两两比较均 P＜0.05）（图 2、3）。这说明荜茇酰胺可促进KRAS突变肺腺癌细胞凋亡。

图2 不同浓度荜茇酰胺干预A549细胞的流式细胞图

2.3 不同浓度荜茇酰胺对A549细胞凋亡相关蛋白PARP、BCL2 表达水平的影响 0、1、5、10μmol/L 荜茇酰胺干预A549细胞后，凋亡相关蛋白PARP、BCL2表达水平比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），其中10μmol/L荜茇酰胺对PARP、BCL2表达水平的影响最明显（均P＜0.05），可上调细胞PARP表达水平，下调BCL2表达水平（图 4、表 1）。

图3 不同浓度荜茇酰胺对A549细胞凋亡的影响

图4 不同浓度荜茇酰胺干预A549细胞后凋亡相关蛋白PARP、BCL2表达电泳图

表1 不同浓度荜茇酰胺干预A549细胞后凋亡相关蛋白PARP、BCL2表达水平比较

2.4 不同浓度荜茇酰胺对A549细胞自噬相关蛋白LC3B表达水平的影响 0、1、5、10μmol/L荜茇酰胺干预A549细胞后，自噬相关蛋白LC3B表达水平比较差异有统计学意义（P＜0.05），其中10μmol/L荜茇酰胺对LC3B表达水平的影响最明显（均P＜0.05），可上调细胞LC3BⅡ表达水平（图5、表2）。

3 讨论

肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，严重危害人类生命与健康。促癌基因鼠肉瘤病毒癌基因(RAS)是非小细胞肺癌患者常见的突变基因，包括神经母细胞瘤癌基因（NRAS）、Harvery鼠肉瘤病毒癌基因（HRAS）和KRAS这3种[6]。在肺腺癌患者中，KRAS突变大约占RAS突变的90%[6-7]。但临床目前尚无针对KRAS突变的有效靶向药物。

图5 不同浓度荜茇酰胺干预A549细胞后自噬相关蛋白LC3B表达电泳图

表2 不同浓度荜茇酰胺干预A549细胞后自噬相关蛋白LC3B表达水平比较

荜茇酰胺具有多种药理作用，参与调节原癌基因、转录因子、活性氧、激酶、蛋白酶体和炎症因子等表达，在癌症、高脂血症、关节炎和狼疮性肾炎等多种疾病中发挥作用[8]。本研究采用不同浓度的荜茇酰胺干预KRAS突变肺腺癌细胞A549，发现荜茇酰胺可明显抑制细胞增殖，提示荜茇酰胺或是治疗KRAS突变肺腺癌的有效药物。

细胞凋亡是多种药物抗肿瘤作用的主要机制之一[9]。本研究结果显示，荜茇酰胺处理KRAS突变肺腺癌细胞A549后，细胞凋亡率明显升高，PARP表达上调，BCL2表达下调。Raj等[5]研究发现，荜茇酰胺可增加人膀胱癌p53细胞上调凋亡调控因子（PUMA）、细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂1A和caspase-3的表达，为荜茇酰胺诱导肿瘤细胞凋亡的机制提供了证据。

细胞自噬广泛存在于真核细胞内，是一种溶酶体依赖性的细胞器和蛋白质降解途径。自噬相关蛋白LC3B在自噬过程中扮演重要角色，其被合成后立刻被剪切成LC3BⅠ。自噬被激活后，LC3BⅠ被修饰形成膜结合形的LC3BⅡ，后者被募集至自噬小体的双层膜上。自噬小体形成是自噬过程中重要环节之一，因此LC3B常被作为监测自噬发生的特异性标志蛋白[10-11]。本研究结果显示，荜茇酰胺干预KRAS突变肺腺癌细胞A549后，LC3BⅡ表达水平明显上调。这提示荜茇酰胺参与调节KRAS突变肺腺癌的细胞自噬。

综上所述，本研究结果显示，荜茇酰胺可抑制KRAS突变肺腺癌细胞增殖，诱导细胞凋亡。荜茇酰胺或可成为治疗KRAS突变肺腺癌的新靶向药物。