肿瘤免疫中CD4+CD25+CD127low/-调节性T细胞作用研究

吴彬 梁华山 赵海霞 杨睿霞 郭亮

肿瘤免疫是指机体免疫系统有效识别、杀伤肿瘤细胞的一系列正常生理过程。当免疫系统识别、激活免疫应答能力降低时，就会出现肿瘤免疫逃逸。调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）是在机体免疫系统中发挥负向调节作用的细胞，拥有免疫无反应性和免疫抑制两大功能[1]。CD4+CD25+CD127low/-Treg 细胞与肿瘤免疫逃逸密切相关，具有抑制CD4+T 细胞和CD8+T 细胞活化、增殖的作用。叉头翼状螺旋转录因子（Foxp3）与免疫调节相关，在细胞的分化和功能维持方面具有重要作用，是Treg 细胞的特异性标记[2]。CD127与Foxp3 在调节性T 细胞表面表达呈负相关，选择CD127low/-作为Treg 细胞标记可排除CD25+的效应性T 细胞，更真实反映Treg 细胞水平[3]。本研究采用流式细胞术检测癌症患者与正常健康人群外周血中CD4+CD25+CD127low/-Treg 比例，同时通过RTPCR 方法检测Foxp3 表达情况，探讨Treg 细胞在肿瘤免疫中的意义。

1 材料与方法

1.1 一般资料 选取2016年1月～2017年12月就诊于我院的78 例癌症患者，男45 例，女33 例；年龄39～87 岁，中位年龄51 岁，所有病例均经病理诊断证实，临床分期根据国际抗癌协会标准，其中肺癌33例、胃癌12 例、结直肠癌10 例、乳腺癌8 例、多发性骨髓瘤7 例、非霍奇金氏淋巴瘤6 例，肾癌2 例。其中I～II 期42 例，III 期20 例，IV 期16 例；入选者均未接受其他治疗。对照组68 例，来自健康体检人群，男38 例，女30 例；年龄35～72 岁，中位年龄45 岁。

1.2 主要试剂 FITC （Mouse Anti-Human） CD4 抗体、APC（Mouse Anti-Human）CD25 抗体、PE（Mouse Anti-Human）CD127 抗体、溶血素购自美国BD 公司，PCR 试剂购自德国QIAGEN 公司。

1.3 流式细胞术检测CD4+CD25+CD127low/-Treg EDTA 抗凝管采集受试者空腹静脉血3ml，取100µl全血标本置于流式管中，分别加20µl 抗体，室温避光孵育15min，加入500µl 溶血素避光孵育10min，加入鞘液2ml，1 500r 离心5min，弃上清，加500µl鞘液重悬细胞后上机。

1.4 real-time PCR 检测Foxp3 表达情况 Foxp3上游引物：5'-CAG CAC ATT CCC AGA GTT CCT C-3'，下游引物：5'-GCG TGT GAA CCA GTG GTA GAT C-3'。参照说明书进行PCR 操作，反应条件为：94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 60s，共30 个循环。以GAPDH 为内参，计算相对表达量。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0 软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t 检验法，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD4+CD25+CD127low/-Treg 细胞比例 通过流式细胞术检测外周血中CD4+CD25+CD127low/-Treg细胞的情况，如图1 所示为一个典型特征结果，以前向散射光FSC 及侧向散射光SSC 设门R1 选取淋巴细胞群，去除碎片；在CD4/SSC 图上显示R1 内的细胞，选取CD4+细胞设门R2，在CD127/CD25 图上显示R2 内的细胞，第二象限UL 为CD4+CD25+CD127low/-Treg 细胞占CD4+细胞比例为7.52%。癌症患者与正常对照组相比，外周血中CD4+CD25+CD127low/-Treg 细胞比例为（5.89±1.74）%显著高于正常对照组（2.17±0.93）%（t=-16.40，P＜0.05）。且不同分期实验组Treg 细胞比例也均显著高于正常对照组（P＜0.05），其中III 期、IV 期癌症患者Treg 细胞比例显著高于I～II 期患者（P＜0.05），III 期和IV 期癌症患者Treg 细胞比例差异无统计学意义（P=0.26）。见表1。

图1 流式细胞术检测CD4+CD25+CD127low/-Treg

表1 各组外周血CD4+CD25+CD127low/-Treg/CD4+T细胞比例（%）

2.2 外周血中Foxp3 表达情况 癌症患者与正常对照组相比，外周血中Foxp3 相对表达量为（2.65±0.92）%显著高于正常对照组（1.57±0.47）%（t=-9.06，P＜0.05），且不同分期实验组Foxp3 相对表达量也均显著高于正常对照组（P＜0.05），其中IV 期癌症患者外周血中Foxp3 表达显著高于I～II 期、III期患者（P＜0.05），I～II 期和III 期癌症患者外周血中Foxp3 表达无显著差异（P=0.06）。见表2。

表2 各组外周血中Foxp3 表达情况

3 讨论

在肿瘤入侵的最初阶段，机体免疫系统可以通过免疫细胞及多种机制清除大多数肿瘤细胞，使机体免疫处于平衡状态；在适应免疫系统后，肿瘤细胞通过变异突破免疫系统的限制，逃避免疫系统的攻击。肿瘤发生免疫逃逸的能力是肿瘤发生最相关的基本特征之一。

免疫细胞主要包括固有免疫细胞和适应性免疫细胞，而T 淋巴细胞与B 淋巴细胞即为适应性免疫细胞。T 细胞中的Treg 细胞可以抑制免疫、控制自身免疫反应，在肿瘤微环境中大量存在。Treg 细胞可以通过多种机制抑制T 细胞的活化和增殖。如Treg 细胞可以抑制APC 表面的MHC 分子和共刺激分子（CD80 和CD86），从而减弱APC 向T 细胞的抗原提呈作用；Treg 细胞可以分泌抑制性细胞因子（如TGF-β、IL-10、IL-35）并消耗γc 细胞因子，达到抑制T 细胞的活化和增殖的作用；Treg 细胞分泌穿孔素和颗粒酶对T 细胞和APC 进行杀伤等[4]。

Treg 细胞免疫表型为CD4+CD25+CD127low/-，通过多种机制参与肿瘤免疫调控，在机体免疫系统中发挥负向调节作用，降低了机体对肿瘤细胞的免疫监视和免疫攻击能力，深入研究调节性T 细胞和肿瘤免疫之间的关系有助于进一步揭示肿瘤发生、发展及迁移机制[5]。Foxp3 是Treg 的特异性核转录因子，对Treg 发育和功能维持起着重要的调节作用。Foxp3 基因突变会导致Treg 发育和功能受损，发生免疫调节紊乱[6]。CD127 在具有免疫抑制作用的Treg 细胞中低表达，在混合淋巴细胞培养中可抑制同源激活T 细胞的能力，并在相同刺激下无自身作用[7]。Frederick 等[8]研究发现CD4+CD25+CD127low/-Treg 细胞在乳腺癌患者的肿瘤免疫逃逸中发挥着作用。Erin 等[9]认为Treg 细胞对肺癌患者肿瘤微环境有影响，可抑制CD8+细胞的抗肿瘤能力，并且与环氧化物酶COX2 共同增强肿瘤的血管再生能力及侵袭能力。韩丽芳等[10]研究了肝细胞癌组织浸润Foxp3+调节性T 细胞与肿瘤免疫的关系，发现Foxp3+调节性T 细胞通过抑制CD8+T 细胞增殖，分泌免疫抑制细胞因子IL-10 抑制肝癌的局部免疫，可能导致肿瘤细胞增殖。

本研究对78 例不同癌症患者外周血中的CD4+CD25+CD127low/-Treg 细胞及Foxp3 表达水平的分析证实，Treg 细胞可以较好的评价癌症患者免疫状况。不同癌症患者者外周血中的CD4+CD25+CD127low/-Treg 细胞比例均显著高于健康人群，与国内外研究结果基本一致[11～14]。同时可以看出，不同分期癌症患者Treg 细胞比例有所差异，提示肿瘤疾病的发展与免疫水平的降低有相关性。正常细胞发生恶性突变后，进一步诱导Treg 细胞增多，而Treg 细胞又在肿瘤微环境中发挥免疫抑制作用，这种协同作用可能会导致癌症进一步进展。因此，通过检测外周血中CD4+CD25+CD127low/-Treg 细胞的数量可更好地评价患者的免疫情况，为癌症的诊断与治疗提供科学临床依据。