手术对非小细胞肺癌患者外周血循环肿瘤细胞的影响

郭继华 杨鲲鹏 张进 葛晓晴 侯露

肺癌为世界上发病率及死亡率最高的恶性肿瘤之一，按组织学分类，可将其分为小细胞肺癌与非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），其中非小细胞肺癌占肺癌的80%～85%[1，2]。20世纪80年代Ashworth 提出循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTC）概念[3]，即存在于外周血液循环中的肿瘤细胞。NSCLC 患者的首要治疗手段是手术治疗。有研究表明，手术治疗可引起术后一过性CTC含量增加[4]，还有研究表明手术治疗不会引起CTC含量增加，而是出现CTC 含量显著性下降[5]。本研究通过检测NSCLC 患者的CTC 情况，探讨CTC 检测在NSCLC 患者治疗中的意义，明确手术治疗对CTC 的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料 选择2018年1月～2019年1月我院胸外科收治的NSCLC 患者58 例，男33 例，女25 例，年龄28～78 岁，平均（59.5±9.2）岁。根据国际抗癌联盟发布的第八版肺癌TNM 分期，分为Ⅰ期24 例，Ⅱ期14 例，Ⅲ期15 例，Ⅳ期5 例。所有NSCLC 患者均行手术治疗，术中均行常规系统淋巴结清扫。纳入标准：①已行手术治疗，术后病理确诊为NSCLC；②未合并其他恶性肿瘤；③临床资料完整。排除标准：①术后病理明确诊断为非NSCLC；②临床资料不够完整；③患者拒绝检测CTC。

1.2 检测系统及试剂 CTC 检测采用Cell Search 自动检测系统[强生（上海）医疗器械有限公司]完成，其中包括 CellTracks AutoPrep 自动分析系统、Celltracks Analyzer Ⅱ自动分析仪和配套的储存管、试剂盒等。

1.3 方法

1.3.1 样本采集 于空腹状态下抽取患者静脉血7.5ml，置入系统专用CellSave 抗凝储存管内，抽取时间为手术前1d、手术后1d、手术后7d、手术后30d，样品于96h 内送检。

1.3.2 CTC 检测 将送检血液标本加入6.5ml 缓冲液充分混匀后以800g 离心10min，将处理后的血液样本送入CellTracks AutoPrep 自动分析系统内进行细胞富集与分离，然后使用MagNest 磁孵育装置，再通过4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、抗CK-藻红蛋白（PE）、抗CD45-别藻蓝蛋白（APC）组成的荧光试剂将其染色，结果由Celltracks Analyzer Ⅱ自动分析仪分析完毕后，由两名工作人员独立进行计数。CK+/DAPI+/CD45-即为CTC 细胞。

1.4 观察指标 ①CTC 阳性率（CTC＞0/7.5ml 为阳性，CTC=0/7.5ml 为阴性）；②患者一般情况，性别、年龄、肿瘤病史等；③肿瘤病理情况，肿瘤类型、肿瘤分期。

1.5 统计学分析 采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析。计量资料中不符合正态分布的数据，组间比较采用Wilcoxon 秩和检验，以中位数及四分位间距表示，符合正态分布的数据组间比较采用t检验，以均数±标准差（±s）表示。计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验或Fisher 精确检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同性别、年龄、病理类型、手术方式患者CTC数值对比 术后1d，年龄≥60 岁患者的CTC 细胞数值高于年龄＜60 岁患者，差异存在统计学意义（P＜0.05），见表1。胸腔镜手术患者术前CTC 细胞数值低于开胸手术组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。男性与女性患者在各时间点的CTC 细胞数值差异均无统计学意义（P＞0.05）。腺癌与鳞癌患者在各时间点的CTC 细胞数值差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表1 不同性别、年龄患者CTC 数值对比

表2 不同病理类型、手术方式患者CTC 数值对比

2.2 不同病理分期患者术前、术后1d CTC 阳性率比较 病理分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者术前、术后1d CTC 阳性率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。其中Ⅰ期患者术前及术后1d CTC 阳性率均低于其他各期患者，差异有统计学意义（P＜0.05），其余各期术前及术后1d 两两比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表3 不同病理分期患者术前、术后1d CTC阳性率比较[n（%）]

2.3 不同时间患者CTC 数值比较 患者术后1d CTC 细胞数值较术前出现一过性上升[12（6.75，15） vs 8（5，12），Z=2.970，P=0.003]，差异有统计学意义。患者术后7d CTC 细胞数值较术后1d呈现下降趋势[9（4.75，13） vs 12（6.75，15），Z=2.266，P=0.023]，差异有统计学意义。患者术后30d CTC细胞数值与术后7d 比较[8（3，11） vs 9（4.75，13），Z=1.223，P=0.221]，差异无统计学意义。

3 讨论

肺癌为我国最常见的恶性肿瘤之一，据我国国家癌症中心发布数据显示5年患病率为1/10 万，男性中居恶性肿瘤第2 位，女性中居恶性肿瘤第4位[6]，对我国国民健康造成严重威胁。手术治疗为NSCLC 的主要治疗手段，但仍有部分患者接受手术治疗后出现术后短期内肿瘤复发情况，说明现有的常规手术治疗手段并不能解决所有恶性肿瘤带来的问题。Ashworth[3]提出循环肿瘤细胞概念，非小细胞肺癌肿瘤侵袭周围血管后，肿瘤细胞会先粘附在血管基底膜上，当肿瘤细胞逐渐增多时，分泌的蛋白酶也将逐渐增多，随后突破基底膜屏障进入血液循环，随着血液循环游走全身，以自我播种的形式形成复发转移。在NSCLC 患者中，CTC 可在任意阶段检测到，动态的CTC 可以反映患者的预后情况[7]。更有研究表明CTC 细胞数量与患者预后呈负相关[8]。

本研究通过检测患者术前及术后CTC 细胞数值的动态变化，了解CTC 与手术操作及患者临床基本情况之间的关系。结果显示，患者术后1d CTC 细胞数值较术前出现一过性上升，随后患者术后7d CTC 细胞数值较术后1d 呈下降趋势，出现此种情况的原因可能由于手术过程中手术器械对肿瘤组织进行牵拉、挤压等操作，致使CTC 细胞进入血液循环中，且手术创伤短期内会对人体免疫机能产生一定抑制作用，导致机体对外周血CTC 细胞灭活数量减少，从而导致术后CTC 细胞数值上升，之后出现术后外周血CTC 细胞数值下降，可能是由于机体内免疫机能于术后创伤后恢复，且外周血CTC 细胞来源—原肿瘤组织被去除，使术后外周血CTC 细胞数值再次出现下降，而不同手术方式患者之间并无明显差异，林赟等[9]研究也得出了术后CTC 数值较术前出现一过性上升的结论。所以手术操作应精细化，避免不必要的操作，减少对肿瘤组织的牵拉。同时，病理分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者间术前、术后1d CTC 阳性率比较存在差异。其中Ⅰ期患者术前及术后1d CTC 阳性率均低于其他各期患者，其余各期患者术前及术后1d 两两比较，差异均无统计学意义。我们认为，可能由于Ⅰ期患者未出现区域淋巴结转移，而其他分期患者均存在区域淋巴结转移，CTC 细胞可由淋巴组织进入血液循环，从而导致此种差异存在。Chen 等[10]及陈志国等[11]研究也得出了不同病理分期之间CTC 细胞阳性率存在差异的结论。术后1d年龄≥60 岁患者CTC 细胞数值高于年龄＜60 岁患者，提示手术过程中对肿瘤组织的牵拉、挤压等操作对老年群体影响更大，可能由于老年人免疫功能有一定程度的下降，而且手术创伤短期内对免疫功能有一定程度的抑制作用，从而导致机体对外周血CTC 细胞灭活数量减少，外周血CTC 检测细胞数增多。胸腔镜手术患者术前CTC 细胞数值低于开胸手术患者，出现这种差异可能是由于分期晚的患者，术前评估手术情况较为复杂，多数行开胸手术，分期早的患者多数为胸腔镜下手术，而分期为Ⅰ期患者术前CTC 阳性率低于其余各分期患者，进而导致此种差异产生。

综上所述，手术可导致NSCLC 患者外周血CTC 细胞出现一过性上升，随后出现下降。术前CTC 与手术方式及病理分期有关，术后1d CTC 与年龄及病理分期有关。