黑龙江东宁境内栽培黑木耳菌株区别性鉴定

马银鹏 包怡红 张丕奇 韩增华 马庆芳 张先成*

（1东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨150040；2黑龙江省科学院微生物研究所，黑龙江哈尔滨150010）

黑木耳（Auricularia heimuer）[1]质地滑嫩、清脆可口，是一种重要的食药用菌[2]。近年来黑木耳产业发展迅速，对黑木耳菌种的需求越来越大，但黑木耳菌种市场“同物异名、同名异物”现象普遍存在（主要由于相互频繁引种并自主命名造成），这给黑木耳品种的知识产权保护带来了很大困难[3]。

为了保护黑木耳种质资源知识产权，有必要了解生产上应用黑木耳菌株规范性，并对黑木耳菌株进行区别性鉴定[4]。随着分子生物技术的发展，分子标记被应用到菌株区别性鉴定中。ISSR（Intersimple Sequence Repeat）是一种简单重复序列间扩增多态性分子标记[5]，具有丰富的扩增多态性，并具有快速、简便、可靠等特点，广泛应用到种质资源鉴定、遗传作图、系统发育、分子标记育种等方面[6]。刘华晶等[7]利用PCR-ISSR体系，选出9个ISSR引物，通过聚类分析成功分析了黑龙江省33个野生木耳菌株和8个栽培菌株的遗传多样性。任广明等[8]采用ISSR分子标记技术构建了黑龙江省伊春地区23个黑木耳主栽品种DNA指纹图谱。

笔者采用ISSR分子标记方法对来自黑龙江东宁县不同单位黑木耳菌株进行区别性鉴定，以评价黑木耳菌种市场的规范化程度。

1 材料与方法

1.1 供试菌株来源

选取2017年春季黑龙江省东宁县两个黑木耳主栽品种，分别以黑木耳1号和黑木耳2号取代市场真实商品名，采集东宁县不同地域（单位）的黑木耳菌株共30株，利用cPDA培养基分离纯化30株黑木耳菌株，经5次纯化后，28株黑木耳菌株无性状分离，形态特性均一稳定。根据菌丝形态特征和对峙试验并结合地区代表性，筛选出10个黑木耳菌株进行ISSR研究（表1）。上述菌株均保藏于黑龙江省科学院微生物研究所菌种保藏中心。

1.2 菌丝体培养及总DNA提取

将纯化后的菌株接入250 mL三角瓶PD培养基中，25℃条件下120 r/min摇瓶培养7 d，9391×g离心收集菌丝体，-20℃保存备用。采用改进的CTAB法提取总DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测样品总DNA质量，紫外分光光度法检测样品总DNA浓度，稀释到相应浓度后-20℃保存备用。

1.3 ISSR-PCR扩增

根据加拿大哥伦比亚大学（UBC）设计的ISSR引物，选择10个多态性高、重复性好的引物（表2）进行PCR扩增，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

反应体系：10 μL 2×Tap Mix（纳川），1 μL引物（0.5 μmol/L），1 μL 总 DNA（50 ng/μL），ddH2O补至20 μL。反应程序：94℃预变性 5 min；94℃变性30 s，相应退火温度退火30 s，72 ℃延伸2 min，35个循环；72℃延伸7 min，4℃保存。1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统拍照记录。每条引物重复扩增3次，筛选出多态性高、重复性好的扩增图谱进行数据分析。

表1 供试黑木耳菌株

表2 ISSR引物序列

1.4 数据分析

比对和校正ISSR扩增图谱，对于同一条引物的扩增图谱，迁移率相同的条带记为一个位点，扩增阳性赋值为“1”，扩增阴性赋值为“0”，构建初始0/1数据矩阵。采用NTsys_2.02软件计算遗传相似系数，基于UPGMA方法构建聚类图谱并进行聚类分析。

2 结果与分析

琼脂糖凝胶电泳检测总DNA（图1），紫外分光光度法检测发现A260与A280比值为1.86，因此，提取到的总DNA可用于ISSR分析。

图1 基因组DNA检测图谱

ISSR-PCR结果发现：从10条引物中筛选出7条引物（引物1、引物2、引物3、引物4、引物7、引物8和引物9）扩增条带具有多态性。扩增条带大小为300～4000 bp。7条扩增具有多态性的引物共扩增出25种条带，其中7种条带具有多态性，多态性比例为28%。

图2 引物7琼脂糖凝胶电泳图谱

表3 10株黑木耳菌株遗传相似系数

利用NTsys_2.02软件对10株黑木耳菌株进行UPGMA聚类分析，结果发现10株黑木耳菌株遗传相似系数为0.72～1（表3）。用NTsys_2.02软件基于UPGMA方法构建系统发生树（图3）。10株黑木耳菌株的遗传相似性较高，在相似系数为0.88处将供试样本分为两大类群。黑木耳1号中的1、2-2、5、11、12、23和黑木耳2号中的15、20共计8个黑木耳菌株聚为一类，遗传相似系数为1，此8株黑木耳菌株为同一个黑木耳品种。黑木耳1号中的8-1和22两个黑木耳菌株聚为一类，遗传相似系数为0.88，这两个菌株与其他8株黑木耳菌株可能为不同的黑木耳品种。

图3UPGMA聚类分析图谱

3 小结与讨论

采用对峙培养法进行黑木耳区别性鉴定，操作方便、成本低，且鉴定结果易于观察[9]。拮抗试验发现10株黑木耳菌株中8-1、22与其他菌株形成沟壑型拮抗线，但是拮抗线不明显。因此，通过拮抗试验较难判断8-1与22为不同黑木耳品种，需要结合细胞学、生化和DNA水平对黑木耳菌株进行区别性鉴定。

ISSR分子标记从DNA水平检测基因组DNA多态性，受环境条件影响很小，可有效鉴定不同黑木耳栽培品种[10]。利用ISSR分子标记研究发现黑木耳2号中的15、20菌株与其他6个黑木耳1号菌株聚为一类，这8株菌株为同一黑木耳品种，因此黑木耳菌种市场存在同物异名现象。黑木耳1号中的8-1和22两个菌株聚为一类，与其他8株黑木耳菌株可能为不同的黑木耳品种，因此黑木耳菌种市场存在同名异物现象。这表明黑木耳菌种引种、命名相对混乱，给黑木耳品种的知识产权保护、菌种质量管理和品种审定带来了很大的困难。品种是丰产的根本，种源不清晰、品种不纯正等可能会造成减产甚至绝产，严重影响黑木耳产业发展，因此亟须规范菌种市场。

王晗等[12]通过酯酶同工酶鉴定不同地区引种的黑木耳菌株，结果将10个菌株分为3个组群。笔者研究结果与其基本一致，因此，ISSR分子标记可以作为一种有效的黑木耳菌株区别性鉴定的方法。其他分子标记如SSR[13-14]和SRAP[15-16]等也已被应用到品种区别性鉴定中，后续需采用多种分子标记相结合的方法共同鉴定不同地区引种的黑木耳菌株。