循环肿瘤细胞数量的变化情况对HER 2阳性早期乳腺癌患者治疗效果及预后的影响

吕勉，潘小明，王慧玲，黄永鸿，杜贤

广西医科大学第三附属医院/南宁市第二人民医院1乳腺甲状腺外科，2检验科，南宁530021

乳腺癌是一种较为常见的女性恶性肿瘤。手术是治疗早期乳腺癌的常用手段，目前，仍有部分患者选择采取此方案进行治疗，但是，近年来，随着对乳腺癌生物学特性认识的逐渐深入，制订适合早期乳腺癌患者的个性化治疗方案越来越受到重视。生长因子、激素受体、原癌基因及抑癌基因的产物是常见的肿瘤标志物，对肿瘤的治疗具有辅助作用，且能够预测肿瘤患者的预后情况。原癌基因——人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）的表达情况是影响乳腺癌患者预后的重要因素[1]。肿瘤转移亦是影响肿瘤患者预后的主要因素。多项关于循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）对肿瘤患者预后预测作用的研究得到了一致的结论，即检测CTC对于监测肿瘤细胞是否发生转移具有重要的意义[2-4]。有研究认为，CTC可作为转移性乳腺癌患者预后的预测指标[5]。另外，CTC可作为早期乳腺癌患者化疗疗效的判断指标，但临床中多关注的是CTC对可行手术的乳腺癌患者的检出率及相关特征，而对于乳腺癌患者治疗前后CTC的变化情况并未进行进一步的观察。因此，本研究选取166例HER2阳性早期乳腺癌患者作为研究对象，观察接受化疗联合手术治疗与接受化疗联合曲妥株单抗治疗后患者外周血中CTC的检出情况、细胞角蛋白19（cytokeratin-19，CK19）的表达水平，旨在为临床诊疗HER-2阳性早期乳腺癌提供参考依据，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2015年1月至2018年1月广西医科大学第三附属医院/南宁市第二人民医院收治的166例HER2阳性早期乳腺癌患者作为研究对象。纳入标准：①经术前穿刺病理学检查诊断为乳腺癌；②穿刺组织免疫组织化学染色结果显示HER2阳性；③TNM 分期为 T2～3N0～2M0期，且具有手术适应证；④无化疗史。排除标准：①孕期或哺乳期妇女；②炎性乳腺癌；③依从性差；④中途退出研究。根据患者的病情和意愿选择治疗方案，根据治疗方案的不同将患者分为手术组（n=68）和曲妥株单抗组（n=98）。手术组患者的年龄为33～59岁，平均年龄为（46.0±12.1）岁；病程为1.8～3.5年，平均病程为（2.4±0.5）年；患者均存在乳腺肿块，其中，伴有皮肤改变者34例，伴有乳头、乳晕异常者29例，伴有腋窝淋巴结肿大者47例；TNM分期：I期27例，Ⅱ期41例。曲妥珠单抗组患者的年龄为33～58岁，平均年龄为（46.0±11.9）岁；病程为1.8～2.7年，平均病程为（2.3±0.2）年；患者均存在乳腺肿块，其中，伴有皮肤改变者49例，伴有乳头、乳晕异常者45例，伴有腋窝淋巴结肿大者73例；TNM分期：I期45例，Ⅱ期53例。两组患者的年龄、病程等基线特征比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。患者及家属均对本研究知情并自愿签署知情同意书，本研究经过医院医学伦理委员会审核批准。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法 两组患者于进行曲妥珠单抗治疗前或手术治疗前均先进行化疗。具体化疗方案：多西他赛75 mg/m2，静脉滴注，第1天；表柔比星90 mg/m2，静脉滴注，第1天。两组患者均以21天为1个化疗周期，共连续化疗6个周期。曲妥株单抗组患者于化疗结束后1个月接受曲妥珠单抗治疗，剂量为每周110 mg，静脉注射，1周为一个治疗周期，共连续治疗52周。手术组患者于化疗结束后1个月接受早期乳腺癌保乳手术治疗。

1.2.2 主要试剂与仪器 血清RNA提取试剂盒购于Promega公司，ABI7500型实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）仪购于上海巴玖实业有限公司，反转录试剂盒购于美国ABI公司。CK19引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设计并合成。CK19的上游引物为5'-ATGCGAAGCCAATATGAGGT-3'，下游引 物 为5'-UAGTAACCTCGGACCTGCTCA-3'。内参β-actin的上游引物为 5-'CCTRCCTGGGTATGGAATCCT-3'，下游引物为5'-GGAGCAATGATCTTGATCTY-3'。

1.2.3 CK19蛋白和CK19 mRNA检测 分别于化疗前、化疗结束后1个月（未予以曲妥株单抗治疗前）、手术或曲妥株单抗治疗3个月后提取血清总RNA，将mRNA反转录成cDNA，按照反转录试剂盒操作说明书进行操作。PCR总反应体系为25 μl，包括反转录产物 0.5 μl，SYBR Green PCR Master mix 12.5 μl，10 mmol/L的上下游引物混合物各0.5 μl，无菌焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水补至 25 μl。反应条件：50℃ 2 min，95℃10 min，94℃ 0.5 min，66℃ 1 min，共循环40次。加样操作按照ABI7500 RT-PCR仪说明书进行操作。根据RT-PCR仪显示的△CT值计算CK19mRNA的相对表达量。采用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法检测两组患者的外周血CK19水平。

1.2.4 CTC检测 分别于化疗前、化疗结束后1个月、手术或曲妥株单抗治疗3个月后抽取患者外周血7.5 ml，保存于CellSave管后于室温条件下移送至实验室进行血样分析，此过程需在4天内完成。具体操作步骤：将血样移入锥形管（样本量15 nl）中，并添加6.5 ml缓冲液与血样混合均匀后离心10 min，离心速度为3000 r/min，离心半径为15 cm，获得离心后的样本溶液待测（获得样本的1 h内取液）。检测使用Cell Search试剂盒（购于武汉默沙克生物科技公司）。将制备好的样本应用Cell Tracks Auto prep系统进行处理，应用Cell Tracks AnalyzerⅡ分析仪对肿瘤细胞进行识别并计数，采用免疫荧光染色法对CTC进行检测。标记物质分别为细胞角蛋白抗体CK18、CK19，抗CD45抗体以及抗核抗体。对CTC检测结果以及CK18、CK19阳性结果的确认和审查由两位独立的研究人员分别进行。

1.3 观察指标

检测两组患者治疗前后CTC数目的变化情况和相关肿瘤标志物CK19蛋白和CK19mRNA的表达水平，从而评价其对两组患者治疗效果和预后的影响。

1.4 统计学分析

采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组别比较采用t检验或重复测量方差分析；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CTC检出率的比较

化疗前，两组患者的CTC检出率均为100%。化疗结束后1个月，两组患者的CTC检出率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗3个月后，两组患者的CTC的检出率明显低于本组化疗结束后1个月，且手术组患者的CTC检出率明显低于曲妥珠单抗组患者，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表1）

表1 两组患者不同时间点CTC检出率的比较[ n（%）]

2.2 CTC检出数目的比较

化疗前和化疗结束后1个月，两组患者的CTC检出数目比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。治疗3个月后，两组患者的CTC的检出数目均明显减少。治疗3个月后，手术组患者的CTC检出数目少于曲妥珠单抗组患者，差异有统计学意义（t=13.196，P＜0.05）。两组患者的CTC检出数目组间比较，差异有统计学意义（F组间=283.232，P组间＜0.01）；两组患者不同时间点的CTC检出数目比较，差异有统计学意义（F时间=189.256，P时间＜0.01）；两组患者的CTC检出数目在组间和时间方面存在交互作用（F时间×组间=78.199，P时间×组间＜0.01）。（表2）

2.3 CK19阳性检出率的比较

治疗3个月后，两组患者的CK19阳性检出率分别低于本组化疗前，差异均有统计学意义（χ2=5.207、6.289，P＜0.05）。化疗前、化疗结束后1个月和治疗3个月后，两组患者的CK19阳性检出率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表3）

表2 两组患者不同时间点的CTC 检出数目（±s）

表2 两组患者不同时间点的CTC 检出数目（±s）

组别曲妥珠单抗组（n=98）手术组（n=68）化疗前81.66±48.65 79.29±39.85化疗接受后1个月70.35±28.89 68.9±30.09治疗3个月后23.35±8.17 11.19±3.38

表3 两组患者不同时间点CK19阳性检出率的比较[ n（%）]

2.4 CK19 mRNA表达水平的比较

治疗3个月后，两组患者的CK19mRNA表达水平明显低于本组化疗前，差异均有统计学意义（t=7.307、6.374，P＜0.01）。化疗前、化疗结束后1个月和治疗3个月后，两组患者的CK19mRNA表达水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。两组患者CK19mRNA的表达水平组间比较，差异无统计学意义（F组间=0.313，P组间＞0.05）；两组患者不同时间点CK19mRNA的表达水平比较，差异无统计学意义（F时间=0.339，P时间＞0.05）；两组患者的CK19mRNA的表达水平在组间和时间方面存在交互作用（F时间×组间=0.607，P时间×组间＞0.05）。（表4）

表4 两组患者不同时间点的CK19 mRNA表达水平（± s）

表4 两组患者不同时间点的CK19 mRNA表达水平（± s）

注：*与本组化疗前比较，P＜0.05

化疗前80.51±60.39 77.25±61.43化疗结束后1个月53.60±40.77 51.55±41.98治疗3个月后24.70±19.34*22.86±19.13*组别曲妥珠单抗组（n=98）手术组（n=68）

3 讨论

研究表明，肿瘤直径、HER2基因的表达情况、雄激素受体的状态和淋巴结转移情况等多种因素均对乳腺癌患者的预后具有一定的影响[7]。施勇等[8]收集了167例腋窝淋巴结阴性≤1.0 cm乳腺癌患者的临床资料，单因素分析结果显示，发病年龄、HER2阳性率、肿瘤直径、组织学分级、腋窝淋巴结转移情况、雌激素受体表达水平、孕激素受体表达水平是影响乳腺癌患者5年生存率的因素。其中，无腋窝淋巴结转移患者的5年生存率为96.0%，HER2表达是乳腺癌患者5年生存率的主要影响因素。李凡周等[9]对218例T1期HER2阳性乳腺癌患者的预后情况进行分析，结果显示，发生腋窝淋巴结转移是T1期HER2阳性乳腺癌患者预后的独立危险因素，抗HER2靶向治疗可提高有脉管浸润或存在腋窝淋巴结转移的患者的3年无病生存率。

CK19表达于单层上皮的上皮细胞中，在组织或细胞中具有高度特异性分布的特点[10]，是检测乳腺癌的重要标志物，是最常见的角蛋白之一，在肿瘤细胞中含量丰富。但是，在多数恶性肿瘤中，CK19在肿瘤早期有血行播散的现象[11]。因此，肿瘤患者外周血中是否存在CTC微转移可以通过检测CK19进行判断。王蒙等[12]检测了44例初治原发性女性乳腺癌患者和15例正常女性志愿者外周血中的CK19细胞，结果显示，在正常女性健康志愿者中未检测到CK19+细胞的表达，在33例原发性乳腺癌患者中可检测到CK19+细胞的表达；循环肿瘤细胞的阳性率与临床分期、淋巴结转移等密切相关，即乳腺癌患者的临床分期越晚，CTC的阳性率就越高；I期乳腺癌患者的外周血中亦检测到了CK19+细胞，表明乳腺癌发病初期即已存在CTC。

CTC是从肿瘤原发灶或是肿瘤转移灶脱落的一类肿瘤细胞，能够通过生物学行为（上皮-间充质转化）迁移入血。CTC发生微转移是肿瘤患者术后复发和转移的重要影响因素[13-15]。研究发现，治疗前，CTC在其他肿瘤患者外周血中的表达水平越高，患者的总生存率越低；治疗后，肿瘤患者外周血中的CTC明显减少，患者的预后较好[16-17]。吴君心等[16]检测了67例鼻咽癌首诊患者外周血中CTC的表达水平，结果发现，CTC在鼻咽癌患者外周血中的阳性率为59.7%，而健康志愿者的外周血中未检测到CTC，并发现鼻咽癌患者外周血中CTC的表达水平与肿瘤N分期有关；而与外周血CTC阴性患者比较，外周血CTC阳性患者的N分期更晚，无进展生存期更短，提示外周血CTC阳性鼻咽癌患者的预后不良。

CTC可作为分析肿瘤患者肿瘤生物学特征的实时样本，及时发现肿瘤患者的生物学变化，临床医师可根据其检测结果及时调整治疗方案，从而实现对患者的个体化治疗。因此，CTC可作为预测化疗或手术对肿瘤患者的治疗效果的重要指标[18]，在为患者制订个体化治疗方案方面发挥着重要的作用。龚丽[19]对乳腺癌患者新辅助化疗前后的外周血CTC进行了检测，结果发现，TNM分期为Ⅱ～Ⅲ期浸润性乳腺癌患者外周血CK19的表达水平明显高于健康志愿者和乳腺良性病变者，联合检测CK19和乳腺小黏蛋白（small breast epithelial mucin，SBEM）可明显提高CTC的阳性检出率（64.3%），而新辅助化疗的总体有效率为62.5%，化疗有效的患者外周血中CK19和SBEM的表达水平明显降低，表明联合检测CK19和SBEM在乳腺癌患者外周血中的表达有助于提高对CTC的阳性检出率；新辅助化疗后，CTC的阳性表达率明显降低，提示临床可动态监测CTC的表达以评价新辅助化疗对外周血微转移的肿瘤细胞的杀伤效果。另外，CTC的数目可作为转移性乳腺癌患者预后情况的观察指标[19-21]。

对于转移性乳腺癌患者的预后情况，可采用CTC进行检测并预测，与传统的组织学检测方法相比，其具有敏感度高、无创、动态监测等多方面的优势。临床中，在治疗乳腺癌的过程中，传统的影像学检查在病变疗效评价方面的价值依然得到一定的认可，但在不可进行测量的病变中却无法对疗效进行准确的判断。此时，CTC检测结果能够提示患者的治疗反应和预后情况，对疗效具有更好的预测价值，进而取代传统的影像学评价方法。CTC检测还有望为研发转移性乳腺癌新的治疗靶点提供思路。王丽娟[21]为寻找乳腺癌早期诊断的敏感靶点，从基因分子生物学水平对CTC进行了研究，分析浸润性乳腺癌患者外周血中CTC的计数情况与乳腺癌分子生物学特征的相关性，结果发现，转移性或复发浸润性乳腺癌患者的外周血CTC具有极高的特异性；CTC计数与乳腺癌的TNM分期有关，当CTC数量≥5时，乳腺癌发生远处转移的可能性明显增高，表明CTC计数可用于独立评价乳腺癌的肿瘤分期、患者病情及其预后。因此，监测CTC是对转移性乳腺癌疗效和预后评价的有效手段。张聚良等[22]对HER2阳性早期乳腺癌患者外周血CTC进行了检测，结果发现，术前，HER2阳性的早期乳腺癌患者外周血CK19的表达均为阳性，而化疗后，患者外周血CK19的阳性表达率明显下降，表明早期乳腺癌患者的外周血CTC与HER2阳性表达密切相关。因此，CTC数目可作为疗效的早期预测指标[23-25]。李世超[26]研究发现，可行手术的女性早期乳癌患者于手术前均可检出存在CTC的表达，其中，部分患者提示存在发生血行转移的风险；而行常规开放手术的患者发生血行转移的风险较行腔镜手术的患者高（P＜0.05；OR=2.79，95%CI：1.05～7.42）；外周血 CTC检测结果为阴性的乳腺癌患者经乳腺癌辅助治疗后可以获得更好的近期疗效。

本研究中，在早期可行手术的HER2乳腺癌患者的外周血中均检测到CTC的表达。治疗后，两组患者的CTC检出率和检出数目均降低，且手术组患者的治疗效果优于曲妥株单抗组患者（P＜0.05），本研究结果与相关文献报道一致[27]。提示对CTC的深入研究有利于进一步掌握转移性乳腺癌患者的治疗效果，并对其预后情况做出更加准确的预测，从而更好地指导临床治疗实践，进一步提高肿瘤治疗策略的有效性。

综上所述，HER2阳性早期乳腺癌患者治疗前后CTC的检测数目会发生明显变化，CTC可作为HER2阳性早期乳腺癌患者治疗效果和预后情况的预测性指标。另外，手术能够作为乳腺癌患者化疗后的首选治疗手段，但是仅限于HER2阳性早期乳腺癌患者，CTC的检测对于不同肿瘤分期的HER2阳性早期乳腺癌患者是否适用，仍需进一步深入研究。