lncRNA UCA 1通过抑制miRNA-203 a对乳腺癌细胞化疗耐药作用的影响

2019-08-26张丹李万军李曾

癌症进展 2019年14期

张丹，李万军，李曾#

陕西省西安交通大学附属三二〇一医院1肿瘤内科，2病理科，陕西汉中723000

乳腺癌是世界范围内导致女性肿瘤患者死亡的第二大原因，其发病率和病死率均较高，2012年约有167.1万女性被确诊为乳腺癌[1]。近年来，乳腺癌的发病机制越来越受到相关学者重视。长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一类新发现的非编码RNA分子，研究显示，乳腺癌晚期患者lncRNA尿路上皮癌相关1（urothelial cancer associated 1，UCA1）基因的表达水平升高，并且ln-cRNA UCA的表达水平与乳腺癌患者的病死率呈正相关[2]。微小 RNA-203（micro RNA-203，miRNA-203）是一种干性抑制性miRNA，其在膀胱癌、卵巢癌等多种人类肿瘤中异常表达，并且miRNA-203表达上调还与肿瘤患者的抗肿瘤药物耐受有关[3-4]。相关研究表明，lncRNA可与miRNA相互调控，从而影响肿瘤的发生、发展[5]。还有研究发现，lncRNAUCA1可以增加膀胱癌的化疗耐药性[6]。本研究对lncRNAUCA1通过抑制miRNA-203a对乳腺癌细胞化疗耐药性的影响进行探讨，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞

人乳腺癌细胞系MCF7购自美国模式培养物集存库（American Type Culture Collection，ATCC），人乳腺癌耐5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）细胞系MCF7/5-FU为本实验室根据5-FU浓度梯度蹄选法，以MCF7细胞系为母本蹄选而成。

1.2 主要试剂及仪器

胎牛血清购自以色列Biological Industries公司，细胞裂解液购自美国Thermo Scientific公司，TRIzol购自北京天根生物有限公司，DMEM及opti-MEM培养基均购自美国Gibco公司；酶标仪购自美国Sigma公司，移液器及配套移液枪头和EP管均购自美国Axygen公司，恒温培养箱购自日本Panasonic公司，ABI7500 Fast PCR仪购自上海闪晶生物科技公司。转染试剂盒购自生工生物工程（上海）有限公司。

1.3 细胞培养及转染

将MCF7、MCF7/5-FU细胞接种于含胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃5%CO2的恒温培养箱中进行培养，待细胞长满培养基后进行传代培养。取处于对数生长期的MCF7、MCF7/5-FU细胞接种于6孔细胞培养板中，将MCF7细胞分为两组：MCF7干扰组，转染UCA1siRNA；MCF7未干扰组，常规培养不做转染处理。将MCF7/5-FU细胞分为两组：MCF7/5-FU干扰组，转染UCA1siRNA；MCF7/5-FU未干扰组，常规培养不做转染处理。具体转染方法：采用opti-MEM培养基（不含胎牛血清）对UCA1siRNA储存液进行稀释，混匀后于室温孵育5 min；将稀释后的UCA1siRNA与Upo2000轻轻混匀，于室温下解育20 min。随后将500 μl脂质体-核酸混合液分别加入4组细胞中，更换新鲜的不含胎牛血清的DMEM培养基，轻轻混匀，于恒温培养箱中培养4～6 h后换用完全培养基，培养箱中继续培养24～96 h，转染过程严格按照操作说明书进行。

1.4 RT-PCR检测lncRNA UCA 1表达水平

取处于对数生长期的MCF7、MCF7/5-FU细胞，细胞裂解液处理后，收集细胞总RNA，加入40 μl无RNA酶的水溶解细胞总RNA，置于-80℃冰箱中保存待用[7]。采用实时定量聚合酶链反应（realtime quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR）对逆转录所得lncRNAUCA1的cDNA进行稀释后，取cDNA、上下游引物、预混液和超纯水混合成20 μl反应体系，于ABI7500 FAST PCR仪上对lncRNAUCA1的表达情况进行定量分析，最后对荧光信号进行收集分析[8]。实验重复3次。

1.5 噻唑蓝（methylthiazolyl tetrazolium，MTT）法检测细胞活力

采用5、10、50、100 μg/ml的奥沙利铂对MCF7干扰组和MCF7未干扰组MCF7细胞进行处理，观察奥沙利铂处理72 h后两组细胞的存活情况，选择两组细胞存活率差别最大的奥沙利铂浓度（10 μg/ml）对MCF7干扰组、MCF7未干扰组、MCF7/5-FU干扰组、MCF7/5-FU未干扰组细胞的存活情况进行分析。采用含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养液将上述4组细胞稀释成单个细胞悬液，并以每孔7500个细胞接种到96孔板中，每孔的体积为200 μl，每个浓度均设置3个复孔；细胞于接种24 h后，弃去原有培养基，更换为由DMEM培养基稀释好的AC溶液，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中继续培养；接着每孔加20 μl MTT溶液继续孵育2 h；最后进行比色：选择490 nm波长，在酶标仪上测出各孔吸光度，记录结果，并以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制细胞的生长曲线或根据吸光度值计算细胞存活率。实验重复3次。

1.6 RT-PCR检测miRNA-203 a的表达水平

采用RT-PCR法对MCF7干扰组、MCF7未干扰组、MCF7/5-FU干扰组、MCF7/5-FU未干扰组细胞中miRNA-203a的表达水平进行检测，具体检测方法同1.4。

1.7 统计学分析

采用SPSS 20.0软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数表示。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNA UCA 1表达水平的比较

MCF7/5-FU细胞中lncRNAUCA1的相对表达量为（0.96±0.13），明显高于MCF7细胞的（0.17±0.09），差异有统计学意义（t=12.239，P＜0.01）。

2.2 干扰lncRNA UCA 1表达对乳腺癌细胞活力的影响

10、50 μg/ml奥沙利铂处理后，MCF7干扰组MCF7细胞的存活率均明显低于MCF7未干扰组，差异均有统计学意义（P＜0.01）；10 μg/ml奥沙利铂处理后MCF7干扰组与MCF7未干扰组MCF7细胞的存活率相差最大，因此本研究选择浓度为10 μg/ml的奥沙利铂进行耐药性研究（表1）。

表1 不同浓度奥沙利铂处理后MCF 7未干扰组和MCF 7干扰组MCF 7细胞存活率的比较（%，± s）

注：*与MCF7未干扰组比较，P＜0.01

奥沙利铂浓度（μg/ml）5 10 50 100 MCF7未干扰组91.23±7.91 92.15±5.73 78.35±7.24 24.14±5.27 MCF7干扰组92.18±6.58 64.36±5.76*54.29±6.69*21.17±6.38

采用10 μg/ml奥沙利铂处理干扰lncRNA UCA1表达后MCF7、MCF7/5FU细胞的生存情况，结果显示：与MCF7未干扰组比较，MCF7干扰组MCF7细胞的存活率明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；与MCF7/5-FU未干扰组比较，MCF7/5-FU干扰组MCF7/5-FU细胞的存活率明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。（表2）

表2 干扰lncRNA UCA 1表达后MCF 7、MCF 7/ 5-FU细胞存活率的比较（%，± s）

注：a与MCF7未干扰组比较，P＜0.01；b与MCF-7/5-FU未干扰组比较，P＜0.01

细胞存活率57.31±4.78 40.26±3.95a 78.61±3.44 59.52±4.13b组别MCF7未干扰组MCF7干扰组MCF7/5-FU未干扰组MCF7/5-FU干扰组

2.3 干扰lncRNA UCA 1表达对乳腺癌细胞中miRNA-203 a表达的影响

MCF7干扰组MCF7细胞中miRNA-203a的相对表达量明显高于MCF7未干扰组，MCF7/5-FU干扰组MCF7/5-FU细胞中miRNA-203a的相对表达量明显高于MCF7/5-FU未干扰组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表3）

3 讨论

乳腺癌患者化疗过程中易出现化疗耐药，而耐药的原因为肿瘤细胞本身发生了改变，导致其对化疗药物的敏感性降低，从而影响患者的治疗效果[9]。因此，改善乳腺癌化疗耐受，提高乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性具有重要意义。目前，肿瘤化疗过程中发生耐药的机制尚未明确，前期的研究仅显示肿瘤耐药与ABC家族等药泵蛋白的表达及肿瘤细胞抗调亡能力的增强等因素有关[10-11]。本研究通过分析lncRNAUCA1抑制miRNA-203a对乳腺癌细胞化疗耐药性的影响，探讨了乳腺癌患者化疗过程中出现化疗耐药的机制。UCA1是参与调节多种肿瘤药物敏感性的lncRNA[3]。相关研究显示，UCA1可以通过WNT6依赖性方式激活WNT信号通路，从而影响肿瘤的化疗耐药性[12-13]。lncRNAUCA1可以通过调节雌激素受体水平参与恶性肿瘤的淋巴结转移，研究表明，失调的lncRNA可以通过多种机制参与乳腺癌药物敏感性的调节[14]。本研究结果显示，MCF7/5-FU细胞中lncRNAUCA1的相对表达量明显高于MCF7细胞，提示lncRNAUCA1与乳腺癌细胞的耐药性有关，lncRNAUCA1的表达上调增强了乳腺癌细胞的化疗耐药性。已有研究表明，miRNA-203已被证明可以抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和骨转移，促进肿瘤细胞凋亡[15-16]。本研究结果显示，MCF7干扰组MCF7细胞中miRNA-203a的相对表达量明显高于MCF7未干扰组，MCF7/5-FU干扰组MCF7/5-FU细胞中miRNA-203a的相对表达量明显高于MCF7/5-FU未干扰组，差异均有统计学意义（P＜0.01），表明lncRNAUCA1可以通过下调miRNA-203a表达，促进乳腺癌细胞的化疗耐药。综上所述，lncRNAUCA1通过抑制miRNA-203a表达，增强乳腺癌的化疗耐药性及增加乳腺癌细胞的活力，lncRNAUCA1可能为乳腺癌提供潜在的治疗靶点。

表3 干扰lncRNAUCA 1表达后MCF 7、MCF- 7/ 5-FU细胞中miRNA-203 a相对表达量的比较（± s）