生姜纸煨工艺的优化

罗 婷， 王佳琪， 江宇勤， 张 希， 张军银， 余凌英

（成都中医药大学， 四川 成都611137）

生姜为姜科植物姜Zingiber officinale Rose 的新鲜根茎[1], 其味辛, 性温, 归肺、 脾二经, 功效发汗解表、 温肺止咳、 温中止呕、 利水消痰、 散寒除湿, 炮制品主要有干姜、 煨姜、 姜炭等, 其中煨姜解表作用减弱, 部分挥发性、 刺激性成分减少, 使得药性缓和, 主要用于温中止呕、腹痛泄泻[2-4], 但目前对其报道较少, 缺乏规范化工艺研究。 因此, 本实验采用正交试验联合星点设计-效应面法优化生姜纸煨工艺[5-6], 为该炮制品规范生产提供依据。

1 材料

6-姜辣素对照品（内标, CHB-J-024, 批号CHB160901）购自四川克洛玛生物科技有限公司, 含有量98%以上。 生姜购于成都市温江区永康超市, 经成都中医药大学卢先明教授鉴定为姜科植物姜Zingiber officinale Rose. 的新鲜根茎。 HPLC 色谱仪, 配置DAD 检测器（日本岛津公司）；BS110S 电子分析天平（德国赛多利斯公司）； KQ-300E 超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。 粗草纸购于成都市温江区农贸市场； 其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 含有量测定（一测多评法）

2.1.1 色谱条件 Shim-pack GIST C18色谱柱（4.6 mm×250 mm, 5 μm）； 流动相乙腈-0.1% 甲酸, 梯度洗脱（0 ～10 min, 45%乙腈； 10～15 min, 45% ～48%乙腈； 15～17 min,48% ～60% 乙 腈； 17 ～43 min, 60% 乙 腈； 43 ～45 min,60%～67%乙腈； 45 ～48 min, 67% ～69% 乙腈）； 体积流量0.5 mL/min； 检测波长282 nm； 柱温25 ℃； 进样量15 μL。

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取6-姜辣素对照品适量,置于25 mL 量瓶中, 甲醇溶解并定容至刻度, 即得（0.050 4 mg/mL）。 色谱图见图1。

图1 各成分HPLC 色谱图

2.1.3 供试品溶液制备 将炮制品切成1～2 mm 小块, 精密称取约1 g, 置于l00 mL 圆底烧瓶中, 精密加入50 mL甲醇, 密塞, 称定质量, 加热回流30 min, 取出, 放冷后甲醇补足减失质量, 摇匀, 滤过, 取续滤液, 0.45 μm 微孔滤膜过滤, 即得。

2.1.4 线性关系考察 取“2.1.2” 项下对照品溶液, 甲醇 稀 释 成 0.010 08、 0.020 16、 0.040 32、 0.060 48、0.080 64、 0.100 8 mg/mL, 在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定。 以质量浓度为横坐标（X）, 峰面积为纵坐标（Y）进行回归, 得方程Y=2×107X-13 172 （r=0.999 1）, 在0.010 08～0.100 8 mg/mL 范围内线性关系良好。

2.1.5 精密度试验 精密吸取“2.1.2” 项下对照品溶液15 μL, 在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定6 次, 测得6-姜辣素峰面积RSD 为0.38%, 表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 取同一供试品溶液15 μL, 于0、 2、4、 6、 12、 24 h 在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定, 测得6-姜辣素峰面积RSD 为1.10%, 表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验 精密称取同一批炮制品6 份, 每份1 g, 按“2.1.3” 项方法制备供试品溶液, 取15 μL, 在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定, 测得6-姜辣素含有量RSD 为1.92%, 表明该方法重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验 精密称取6-姜辣素含有量已知的同一批炮制品6 份, 精密加入适量6-姜辣素对照品, 按“2.1.3” 项 下 方 法 制 备 供 试 品 溶 液, 取15 μL, 在“2.1.1” 色谱条件下进样测定, 测得6-姜辣素平均回收率为96.52%, RSD 为2.31%。

2.2 正交试验

2.2.1 因素水平 以粗草纸层数（A）、 煨制温度（B）、煨制时间（C） 为影响因素, 6-姜辣素、 8-姜酚、 10-姜酚含有量为评价指标, 每个因素3 个水平, 采用L9（34） 正交表进行设计[7-10]。 因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平

2.2.2 炮制品制备 取大小均一的生姜9 份, 每份150 g,浸湿的粗草纸包裹。 取5 倍量细沙（过3、 6 号筛） 置于不锈钢锅中, 预热, 将包裹好的生姜放进锅中, 细沙均匀盖住, 测定中间位置温度至实验要求后取出, 即得。

2.2.3 试验设计 按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液,在“2.1.1” 项下色谱条件下进样测定, 计算含有量。 根据2015 年版《中国药典》 要求, 将6-姜辣素含有量权重系数确定为0.5, 8-姜酚、 10-姜酚含有量均为0.25, 计算综合评分[11], 公式为综合评分= （6-姜辣素含有量×0.5/最大值+8-姜酚含有量×0.25/最大值+10-姜酚含有量×0.25/最大值） ×100, 结果见表2, 方差分析见表3。

表2 正交试验设计及结果

表3 正交试验方差分析

由表2 可知, 各因素影响程度依次为B＞C＞A； 由表3可知, 因素A、 C 影不显著 （P ＞0.05）, B 有显著影响（P＜0.05）, 最优工艺为A2B1C2, 即粗草纸3 层, 煨制温度120 ℃, 煨制时间120 min。

2.3 星点设计-效应面法 表2 显示, 粗草纸层数（A） 对实验结果影响最小, 故未对其作继续考察, 固定为3 层,采用星点设计-效应面法进一步优化煨制温度、 煨制时间。

2.3.1 因素水平 以煨制温度（X1）、 煨制时间（X2） 为影响因素, 每个因素5 个水平, 因素水平见表4。

表4 星点设计-效应面法因素水平

2.3.2 试验设计 采用“归一化” 法, 每个指标均标准化为0～1 间的“归一值”, 计算几何平均数, 得总评“归一值” （OD）, 公式为OD= （d1d2…dn）1/n, 其中n 为指标数。 再采用Hassan 法分别计算dmin、 dmax, 公式分别为dmin= （ymax-yi） / （ymax-ymin）、 dmax= （yi-ymin） / （ymaxymin）[12]。 结果见表5。

表5 星点设计-效应面法设计及结果

2.3.3 模型拟合 将表6 数据导入Design-Expert 8.0.6 软件进行回归拟合, 得方程OD=-22.550 25+0.178 12X1+0.233 12X2+ 1.925 58× 10-4X1X2- 9.445 68× 10-4X12 -1.049 75×10-3X22 （R2=0.932 4）, 方差分析见表6。 由表可知, 模型具有显著影响（P ＜0.05）, 而失拟项不显著（P＞0.05）, 表明模型拟合度良好； 因素X1、 X2均有显著影响（P＜0.05）, 程度依次为X1＞X2。

表6 星点设计-效应面法方差分析

2.3.4 响应面分析 通过Design-Expert 8.0.6 软件绘制响应面图, 见图2。 结合正交试验结果, 得到最优工艺为生姜150 g, 粗草纸3 层, 煨制温度113.1 ℃, 煨制时间125.25 min。

2.3.5 验证试验 进行3 批验证试验, 结果见表7, 可知该工艺稳定可靠, 符合实际要求。

表7 验证试验结果（n=3）

图2 各因素响应面图

3 讨论

正交试验能将试验次数降到最低, 又能提供较多的试验信息, 但它采用线性模型进行分析, 难以全面预测各因素水平间的效应变化, 存在一定局限性； 星点设计-效应面法是以非线性模型进行拟合, 分析各因素水平对效应值的影响, 精密度优于正交试验, 可更好地优化工艺条件[13-14]。 因此, 本实验先采用正交试验, 再通过星点设计-响应面法优化生姜纸煨工艺。

2015 年版《四川省中药饮片炮制规范》 中记载, 煨法是用多层浸湿的粗草纸包裹, 置热火灰中煨至纸呈焦黑色或熟透, 其中热火灰起到传热作用； 本实验采用固定质量的河沙（过3、 6 号筛） 代替热火灰传热, 来源方便, 可重复利用, 增加了操作性, 但它能否完全代替热火灰尚不明确, 还需进一步研究。