梣酮对LPS 介导MH7A 细胞增殖和迁移的影响

左瑞庭， 王西彬

[河南省中医院（河南中医药大学第二附属医院）， 河南 郑州450002]

类风湿性关节炎是一种系统性自身免疫性疾病, 目前已知滑膜细胞、 淋巴细胞、 软骨细胞等多种细胞类型参与其发生发展, 其病理特点主要包括滑膜衬里细胞增生、 炎性细胞浸润等等[1]。 风湿性关节炎成纤维滑膜细胞作为一种类 “肿瘤细胞”, 其恶性增生、 侵袭、 迁移在类风湿性关节炎的发生发展过程中发挥重要作用[2]。 目前, 临床上针对类风湿性关节炎的治疗目标主要是减少疼痛, 减缓进一步损害[3]。

梣酮是白鲜皮Dictamnus dasycarpus Turcz. 有效成分, 具有神经保护、 抑制癌症、 抗炎作用[4],可通过抑制NF-κB 信号通路、 NLRP3 炎症小体来改善结肠炎小鼠的炎性浸润[5], 近期有研究发现给予梣酮后小鼠有滑膜炎症和破骨细胞生成[6],但其对滑膜细胞增生及迁移的作用尚未见报道。 因此, 本实验观察梣酮对LPS 介导滑膜细胞增殖和迁移的影响。

1 材料

类风湿关节炎滑膜成纤维细胞系MH7A （日本理化学研究所）； 胎牛血清（FBS）、 RPMI 1640 细胞培养基（美国Hyclone 公司）； BrdU 试剂盒（瑞士Roche 公司）； LPS 和青霉素/链霉素 （美国Sigma 公司）； CCK-8 试剂盒、 乳酸脱氢酶（LDH）释放试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；MMP1、 MMP9、 MMP13、 p-JNK、 t-JNK、 p-STAT3、 t-STAT3、 β-actin 抗 体 （英国Abcam 公司）； 辣根过氧化酶标记的二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）。 梣酮（批号B20136, 含有量≥98%, 上海源叶生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 细胞培养及分组 MH7A 细胞接种于含10%FBS、 1%青霉素/链霉素的RPMI 1640 培养基中,在5%CO2、 37 ℃培养箱中培养, 随机分为对照组（细胞经等体积PBS 处理24 h）、 LPS 组（细胞经10 μg/mL LPS 处理24 h）、 梣酮低剂量组（细胞经10 μmol/L 梣酮预处理30 min, 再经LPS 处理）、梣酮中剂量组（细胞经20 μmol/L 梣酮预处理30 min, 再经LPS 处理）、 梣酮高剂量组（细胞经50 μmol/L 梣酮预处理30 min, 再经LPS 处理）。

2.2 细胞活性检测 采用CCK-8 法。 按照5×103/孔的密度将细胞接种于96 孔板中, 培养24 h后按“2.1” 项下方法处理, 每组3 个复孔。 实验结束后弃除培养基, PBS 缓冲液清洗3 次, 每孔加入无血清培养基100 μL、 CCK-8 溶液10 μL, 于37 ℃、 5% CO2培养箱中孵育1.5 h, 酶标仪在450 nm波长处测定吸光度, 以630 nm 为参考波长。

2.3 LDH 释放检测 细胞接种于96 孔板中, 培养24 h 后10、 20、 50 μmol/L 梣酮处理24 h。 在预定检测点前1 h, 在样品最大酶活性对照孔中加入LDH 释放试剂, 实验结束后离心培养板, 各孔取120 μL 上清液于另一培养板中, 加入60 μL LDH 检测工作液, 室温下反应30 min, 酶标仪在490 nm 波长处测定各孔吸光度。

2.4 BrdU 掺入 按照5×103/孔的密度将细胞接种于96 孔板中, 培养24 h 后按“2.1” 项下方法处理。 收样前8 h, 掺入终浓度10 mmol/L 的BrdU, 弃上清, 加入200 μL 固定变性液室温下反应30 min, 弃上清, 加入100 μL anti-BrdU-POD 工作液, 室温下反应90 min, 弃上清, 各孔加入100 μL底物反应15 min, 2 mol/L 终止反应。 然后,酶标仪在450 nm 波长处测定各孔吸光度, 以690 nm为参考波长。

2.5 Transwell 实验 将细胞接种于6 孔板中, 待融合度达到60% ～70%时, 按“2.1” 项下方法分组（梣酮各剂量组用相应药物预处理30 min）, 24孔板中放入8 μm 小室, 取100 μL 密度1.0×105/mL的细胞悬液接种于上室中, 下室中加入600 μL完全培养基（含10 μg/mL LPS, 以及10、20、 50 μmol/L 梣酮）, 培养箱中迁移24 h。 取出上室, 清洗3 次后甲醇固定30 min, 0.1%结晶紫染色20 min, 于显微镜下随机选取5 个视野计数, 取平均值作为迁移细胞数。 细胞侵袭实验与迁移实验类似, 接种细胞前小室铺上Matrigel 胶, 培养箱中放置48 h, 经固定、 染色后计算迁移、 侵袭细胞数。

2.6 MMP1、 MMP9、 MMP13、 p-JNK、 p-STAT3蛋白表达检测 采用Western blot 法。 培养MH7A细胞, 按“2.1” 项下方法处理, 实验结束后弃培养基, PBS 清洗细胞3 次, 加入细胞裂解液, 4 ℃下 反 应 15 min。 刮 取 细 胞, 超 声 裂 解,12 000 r/min离心15 min, 收集上清, BCA 试剂盒测定各组样品蛋白浓度。 50 μg 蛋白在SDS-PAGE胶上分离并转移至NC 膜上, 5%脱脂牛奶封闭1 h,加入MMP1、 MMP9、 MMP13、 p-JNK、 p-STAT3、t-JNK、 t-STAT3、 β-actin 的一抗, 4 ℃下过夜孵育, TBST 洗膜3 次, 加入辣根过氧化酶标记的二抗, 室温下反应1 h, 加入显色液反应1 ～2 min,显影, 通过Image J 软件统计各蛋白条带的灰度值。

2.7 统计学分析 通过GraphPrism 5.0 软件进行处理, 数据以s） 表示, 组间比较采用单因素方差分析。 P＜0.05 表示具有显著差异。

3 结果

3.1 梣酮对MH7A 细胞活性、 LDH 释放的影响 图1 显示, 与对照组（0 μmol/L） 比较, 梣酮各剂量组细胞活性、 LDH 释放无显著差异（P ＞0.05）。

图1 梣酮对MH7A 细胞活性（A）、 LDH 释放（B） 的影响Fig.1 Effects of fraxinellone on MH7A cell viability （A） and LDH release （B）

图2 梣酮对MH7A 细胞增殖的影响Fig.2 Effects of fraxinellone on MH7A cell proliferation

3.2 梣酮对MH7A 细胞增殖的影响 图2A 显示,与对照组比较, LPS 组细胞活性显著升高 （P ＜0.05）； 与LPS 组比较, 梣酮组细胞活性显著降低（P＜0.05）, 并呈现剂量依赖性。 图2B 显示, 与对照组比较, LPS 组BrdU 相对掺入量显著升高（P＜0.05）； 与LPS 组比较, 梣酮组BrdU 相对掺入量显著降低（P＜0.05）, 并呈现剂量依赖性。

3.3 梣酮对细胞侵袭、 迁移的影响 图3A 显示,与对照组比较, LPS 组细胞侵袭数显著增加（P＜0.05）； 与LPS 组比较, 梣酮组显著抑制细胞侵袭（P＜0.05）, 并呈剂量依赖性。 图3B 显示, 与LPS组比较, 梣酮组细胞迁移数显著降低（P＜0.05）。图3C 显 示, 与 对 照 组 比 较, LPS 组 MMP1、MMP9、 MMP13 蛋白表达显著升高（P＜0.05）； 与LPS 组比较, 梣酮组三者蛋白表达显著降低（P＜0.05）。

3.4 梣酮对JNK、 STAT3 信号通路的影响 图4显示, 与对照组比较, LPS 组p-JNK、 p-STAT3 蛋白表达显著上调（P ＜0.05）； 与LPS 组比较, 梣酮组两者蛋白蛋白显著下调（P＜0.05）, 并呈剂量依赖性。

4 讨论

类风湿性关节炎是最常见的自身免疫性疾病之一, 由全身性T 细胞、 B 细胞失调引起, 进而导致慢性炎症、 滑膜恶性增生、 关节软骨破坏[7]。 其中,成纤维滑膜细胞是增生性滑膜中主要细胞类型, 呈现类肿瘤样增生, 侵入软骨及股骨而导致炎症加重、骨降解, 促进病情发展[8], 故如何阻止成纤维滑膜细胞恶性增生及迁移是目前的研究热点之一。

本实验发现, 梣酮能有效抑制LPS 诱导MH7A细胞的增殖及迁移。 该成分存在于多种中草药（如白鲜、 苦楝、 松果菊等）, 具有多种药理活性,如抗血小板凝集、 舒张血管[9]、 抗菌[10]等作用；抑制LPS 诱导的炎症反应[11], 在急性肝损伤中抗炎活性明显[12]； 阻碍癌细胞增殖、 微管形成, 抑制侵袭、 迁移、 裸鼠移植瘤生长[4]； 也是抗癌药增生平片的主要成分, 可抑制口腔鳞癌细胞增殖[13], 表明梣酮具有抗癌活性, 本实验结果与上述研究一致。另外, MH7A 作为“类肿瘤细胞”, 其增殖、 侵袭、迁移能力在梣酮处理后被明显抑制。

MMPs 在关节滑液中的堆积和激活与关节韧带损伤后的自我修复能力密切相关, 在关节炎滑膜细胞中其表达明显上调[14-15], 研究表明它几乎能降解软骨基质中所有成分, 故抑制其活性或表达可对软 骨 起 到 一 定 的 保 护 作 用。 MMP1、 MMP9、MMP13 是MMPs 家族3 个重要成分, 本实验发现梣酮可有效降低三者表达, 表明该成分不仅抑制了滑膜细胞增殖和迁移, 而且可通过负调控MMPs 在关节炎中发挥保护作用。

图3 梣酮对MH7A 细胞侵袭和迁移的影响Fig.3 Effects of fraxinellone on MH7A cell invasion and migration

图4 梣酮对JNK （A）、 STAT3 （B） 信号通路的影响Fig.4 Effects of fraxinellone on JNK （A） and STAT3 （B） signaling pathways

多项研究发现, 梣酮能调控多种信号通路, 如与细胞生长、 细胞周期、 癌细胞浸润和转移密切相关的JNK、 STAT3、 NF-κB 信号通路。 其中, JNK在类风湿性关节炎成纤维滑膜细胞和滑膜组织中激活, 故抑制该信号通路可改善关节炎小鼠足肿胀[16], 而激活后能促进滑膜细胞中炎症因子分泌和表达[17]； STAT3 对成纤维滑膜细胞生长及存活具有重要作用, 抑制后可诱导滑膜细胞凋亡[18]；阻断两者信号通路后, 可降低滑膜细胞的侵袭和迁移能力[19], 可能有效抑制类风湿性关节炎发生发展。 有研究表明, 梣酮可下调JNK、 STAT3 表达[4,20], 与本实验结果类似, 提示该成分可能通过负调控JNK、 STAT3 信号通路来抑制MH7A 细胞增殖及迁移。

综上所述, 梣酮可负调控JNK、 STAT3 信号通路, 抑制MH7A 细胞增殖, 阻碍侵袭和迁移, 并下调MMP1、 MMP9、 MMP13 蛋白表达, 本实验可为该成分防治类风湿性关节炎提供一定理论基础。