通过式固相萃取净化/超高效液相色谱-串联质谱法测定黄瓜、番茄及豇豆中的克百威与涕灭威残留

覃国新,劳水兵,莫仁甫,闫飞燕,王 静,金茂俊,何 洁,周其峰,杨玉霞,王海军,陈 伟

(1.广西壮族自治区农业科学院 农产品质量安全与检测技术研究所,农业部甘蔗品质监督检验测试中心(南宁),广西 南宁 530007；2.中国农业科学院 农业质量标准与检测技术研究所,农业部农产品质量安全重点实验室,北京 100081)

黄瓜、番茄和豇豆是人们日常生活中常见的蔬菜,具有生长期较短、市场流通快等特点,但容易受霜霉病、灰霉病、根腐病、灰色疫等病虫的危害,虽然杀虫剂、杀菌剂等农药的使用在一定程度上防治了病虫害,并提高了蔬菜产量,但也造成了蔬菜中的农药残留。克百威、涕灭威属于氨基甲酸酯类农药,常用作杀虫剂和杀菌剂而被广泛应用[1-3],虽然国家已禁止使用克百威和涕灭威,但其作为高效广谱的杀虫剂仍广泛用于农业生产中[4-5],克百威和涕灭威在自然界中降解比较快,在农作物中主要以3-羟基克百威、涕灭威砜、涕灭威亚砜等代谢产物形式存在,对人类健康和生态环境势必会造成严重的毒害[6-7]。因此,需同时监测农药母体及其代谢物的残留量,才能达到有效监控食品安全的目的。

我国国家强制性标准《食品中农药最大残留限量》(GB 2763-2016)[8]规定瓜类和豆类蔬菜中克百威及3-羟基克百威之和的最大残留量为0.02 mg/kg,涕灭威及涕灭威砜、涕灭威亚砜之和的最大残留量为0.03 mg/kg。已有检测克百威和涕灭威的方法主要为气相色谱法[9]、气相色谱-串联质谱法[10-11]、液相色谱[12-13]、液相色谱-串联质谱法[14-15]等。但这些方法的样品前处理需多次提取、固相萃取净化、衍生化等操作,操作繁琐、费时,很难满足大批样品的快速、高通量检测需求。

目前,蔬菜中克百威等氨基甲酸酯类农药残留一般采用固相萃取或QuEChERS方法进行前处理,高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)进行检测[16-17]；而采用通过式固相萃取净化进行样品前处理的研究仅有几篇文献报道,如励炯等采用通过式固相萃取技术,提取液使用Oasis PRiME HLB固相萃取柱通过式净化,建立了特殊医学用途配方食品中13种非法添加降糖类化学成分的分析方法,方法无需复杂的样品前处理,不仅有效降低了基质效应,而且提高了分析的灵敏度和选择性[18]；高洁等采用新型通过式固相萃取技术结合超高效液相色谱-串联质谱法,建立了同时测定猪肉中52种同化激素的快速分析方法,样品经乙腈涡旋提取后,用Oasis PRiME HLB固相萃取柱通过式净化,多反应监测模式检测,不仅操作简单,分析速度快；而且灵敏度高,准确可靠[19]。可见,采用通过式固相萃取净化技术,大大缩短了样品前处理时间,从而有效提高检测效率。但目前尚未见采用通过式固相萃取技术对黄瓜、番茄和豇豆等蔬菜中克百威和涕灭威及其代谢物残留进行前处理的研究报道。因此，本研究采用乙腈和QuEChERS提取盐包提取,经Oasis PRiME HLB柱通过式固相萃取净化,超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法测定,建立了同时检测黄瓜、番茄和豇豆中克百威、3-羟基克百威、涕灭威、涕灭威砜和涕灭威亚砜残留的分析方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Xevo TQ-S型超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪(UPLC-MS/MS)(配有电喷雾离子源,美国Waters公司)；DS-1型高速组织捣碎机(上海标模仪器厂)；LD5-2A型低速离心机(北京京立离心机有限公司)；Oasis PRiME HLB通过式固相萃取柱(3 cc,150 mg,2 mL,部件号186008717,使用前无需活化,沃特世科技(上海)有限公司)；克百威(1 000 mg/L)和3-羟基克百威(1 000 mg/L)标准品购于北京振翔科技有限公司；涕灭威(100 mg/L)、涕灭威砜(100 mg/L)和涕灭威亚砜(100 mg/L)标准品均购于上海安普实验科技股份有限公司；QuEChERS提取盐包(含0.5 g柠檬酸二钠盐水合物、1 g 无水柠檬酸钠、1 g氯化钠、4 g MgSO4,部件号186006813,沃特世科技(上海)有限公司)；乙腈(色谱纯,赛默飞世尔(中国)科技有限公司)。

1.2 标准溶液的配制

准确移取2种农药及其代谢物标准溶液,用乙腈配成质量浓度为10 mg/L的标准中间混合溶液,使用时用溶剂或空白基质提取液逐级稀释至所需浓度。

1.3 样品前处理

取新鲜黄瓜、番茄和豇豆试样(购于本地市场)，用组织捣碎机粉碎并混匀,准确称取10.00 g,加入20.0 mL乙腈,涡旋提取1 min,再加入QuEChERS提取盐包,涡旋提取1 min,以4 000 r/min离心5 min,收集上清液,供Oasis PRiME HLB固相萃取柱净化。

将Oasis PRiME HLB固相萃取柱(无需活化)安装到预先清洁过的锥形瓶上,取2 mL上清液通过Oasis PRiME HLB柱并收集全部滤液,过0.22 μm有机微孔滤膜,供UPLC-MS/MS测定。

1.4 超高效液相色谱-质谱条件

1.4.1 色谱条件色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm,美国Waters公司)；流动相：A为乙腈,B为0.1%甲酸溶液。梯度洗脱程序：0～0.8 min,10%～40% A；0.8～2.8 min,40%～60% A；2.8～3.8 min,60%～80% A；3.8～4.7 min,80%～90% A；4.7～5.7 min,90% A；5.7～6.0 min,90%～10% A；6.0～7.0 min,10% A；柱温35 ℃,流速0.3 mL/min,进样体积2.0 μL。

1.4.2 质谱条件采用电喷雾ESI+离子源,多反应监测(MRM)模式,脱溶剂气温度400 ℃,电喷雾电压3.0 kV,离子源温度150 ℃,脱溶剂气流速700 L/h。在分析过程中,以离子对(母离子和两个子离子)信息进行定性分析；以母离子和响应值最高的子离子进行定量分析。克百威、3-羟基克百威、涕灭威、涕灭威砜、涕灭威亚砜在多反应监测模式下的质谱参数见表1。

表1 克百威、3-羟基克百威、涕灭威、涕灭威砜和涕灭威亚砜的质谱参数Table 1 MS/MS parameters for the analysis of carbofuran,carbofuran-3-hydroxy,aldicarb,aldicarb-sulfone and aldicarb-sulfoxide

*quantitative ion

2 结果与讨论

2.1 仪器条件的优化

2.1.1 质谱条件的优化采用0.5 mg/L待测化合物标准溶液,分别在正离子(ESI+)和负离子(ESI-)模式下进行全扫描。结果显示,2种杀虫剂及其代谢物均在ESI+模式下响应值更高,因此选择正离子扫描方式,并确定了克百威、3-羟基克百威、涕灭威、涕灭威砜、涕灭威亚砜母离子分别为m/z222.1、238.0、213.1、223.0、207.0。其它优化后的质谱参数见表1。

2.1.2 色谱条件的优化实验对比了甲醇和乙腈为有机流动相的分析效果,发现采用乙腈时各待测物峰形较好且响应值更高,因此选择乙腈-0.1%甲酸溶液为流动相,并优化了流动相梯度洗脱条件,使待测农药的灵敏度和重现性均较好。另外,实验比较了BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)和HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)2种色谱柱的分离效果,结果发现采用BEH C18色谱柱分析时,待测农药的峰形和保留时间均较理想。在优化色谱-质谱条件下,2种农药及其代谢物在黄瓜、番茄和豇豆加标样品中的MRM色谱图如图1所示,由图可见,样品基质不干扰2种农药及其代谢物的测定。

图1 2种杀虫剂及其代谢物在黄瓜、番茄和豇豆混合空白样品基质加标(0.05 mg/kg)下的MRM色谱图Fig.1 MRM chromatograms of 2 kinds of insecticides and its metabolites of mixed blank samples of cucumber,tomato and cowpea spiked at 0.05 mg/kg level

2.2 净化方式的选择

样品的提取和净化作为检测方法的关键技术,直接影响方法的回收率、灵敏度和精密度,尤其是植物源性食品中存在的大量色素会随着目标化合物被提取出来,基质干扰严重。本文采用乙腈涡旋提取1 min,加入QuEChERS提取盐包,再涡旋提取1 min,离心后,上清液直接加载至Oasis PRiME HLB固相萃取柱以吸附色素等干扰物质,与传统非通过式固相萃取净化比较,本方法上样前无需活化和平衡柱子,且不涉及洗脱和浓缩程序,显著缩短了样品前处理时间,操作更简单,且方法回收率和精密度均满足检测要求。

2.3 样品基质效应的考察

取不含待测物的黄瓜、番茄和豇豆空白样品,经“1.3”方法处理后,到空白基质提取净化液,用此基质提取净化液逐级稀释10 mg/L的待测物混合标准溶液,配成0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5 mg/L的基质提取净化标准工作液。在优化的条件下进样测定,以待测物质量浓度(X,mg/L)为横坐标,对应定量离子对峰面积(Y)为纵坐标绘制基质匹配标准曲线。以基质匹配标准曲线斜率/纯溶剂标准曲线斜率计算基质效应(ME),斜率比越接近1,表示基质效应越小,结果见表2。结果显示,克百威和涕灭威及其代谢物3-羟基克百威、涕灭威砜、涕灭威亚砜均存在较大的基质效应(ME<0.8),这可能与样品基质、化合物性质和离子化效果等因素相关。因此,为减小样品基质效应,本实验选择基质匹配标准曲线外标法定量。

表2 黄瓜、番茄和豇豆中2种杀虫剂及其代谢物的基质效应Table 2 Matrix effects of 2 kinds of insecticides and its metabolites residues in matrix of cucumber,tomato and cowpea

2.4 方法的线性范围、检出限与定量下限

在优化条件下,黄瓜、番茄和豇豆中的克百威、3-羟基克百威、涕灭威、涕灭威砜和涕灭威亚砜在0.001～0.5 mg/L范围内具有良好的线性关系(见表2),相关系数均大于0.996 0。以3倍信噪比(S/N=3)计算得克百威、3-羟基克百威、涕灭威、涕灭威砜和涕灭威亚砜的检出限(LOD)分别为0.07、0.3、1.0、4.0、13 μg/kg,以S/N=10计算得其定量下限(LOQ)分别为0.2、1.0、2.0、13、42 μg/kg。方法中各待测物的LOD均比国家限量标准值低[8],完全满足日常检测需求。

2.5 回收率与精密度

取市售未检出2种农药及其代谢物的黄瓜、番茄和豇豆样品为空白进行低、中、高3个浓度水平的加标回收实验(通过式净化方式和非通过式净化方式比较),10 g匀浆样品中克百威、3-羟基克百威、涕灭威和涕灭威砜加标浓度为0.02、0.05、0.2 mg/kg,涕灭威亚砜为0.05、0.1、0.2 mg/kg,在优化条件下测定,结果见表3。结果显示,克百威和涕灭威及其代谢物3-羟基克百威、涕灭威砜、涕灭威亚砜在黄瓜、番茄和豇豆中通过式和非通过式2种净化方式的平均回收率分别为80.4%～110%和74.5%～99.6%,相对标准偏差(RSD)分别为1.1%～4.8%和1.4%～5.9%。由此可见,2种方法的回收率和精密度均满足检测要求,但本方法操作更简单,样品前处理时间更短,且回收率整体较高。

表3 实际样品中2种杀虫剂及其代谢物残留量回收率和相对标准偏差(n=6)Table 3 Recoveries and RSD(n=6) of 2 kinds of insecticides and its metabolites resideces in real samples

2.6 实际样品检测

从本地农贸市场分别随机抽取10份黄瓜、番茄和豇豆对其中的克百威、3-羟基克百威、涕灭威、涕灭威砜和涕灭威亚砜进行检测,均未检出上述农药残留。

3 结 论

本研究采用新型通过式固相萃取技术,建立了超高效液相色谱-串联质谱法测定黄瓜、番茄和豇豆中克百威和涕灭威及其代谢物(3-羟基克百威、涕灭威砜、涕灭威亚砜)残留的分析方法。采用通过式固相萃取技术,上样前无需活化和平衡,以Oasis PRiME HLB替代常规填料GCB对样品进行净化,不但能去除色素、磷脂等干扰杂质且能保持待测物较高的回收率,同时有效的缩短了样品前处理时间,方法操作简便、灵敏度高、定量下限低、稳定可靠,满足蔬菜中克百威和涕灭威及其代谢物残留检测与确证的需要。将其用于黄瓜、番茄和豇豆中克百威和涕灭威及其代谢物残留的检测分析,结果令人满意。