微波一步法制备氮掺杂碳点及其用于多巴胺的检测研究

孟铁宏，李春荣，王 恒，姜艳萍，赵鸿宾，余跃生，胡先运,2*

(1.黔南民族医学高等专科学校，贵州 都匀 558000;2.贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州 贵阳 550002)

多巴胺(DA)是人体内一种重要的儿茶酚胺类神经传递物质，是体内去甲肾上腺素或肾上腺素生物合成的前体，对神经中枢、心血管、肾脏及激素分泌系统以及中枢神经系统的精神活动有重要的调节作用。若人体内的多巴胺分泌不足，可能导致神经肌肉失调[1]，甚至引发帕金森氏症[2]、老年痴呆症[3]、癫痫症[4]、心脏病等疾病，因此，体内多巴胺含量可作为临床上一些疾病的重要诊断依据，对多巴胺进行简单、快速、准确的检测具有十分重要的理论意义和临床应用价值。已报道的多巴胺检测方法主要有分光光度法[5]、荧光光度法[6]、化学发光法[7]、高效液相色谱法[8]、电化学分析法[9]等，其中，荧光光度法具有操作简单、灵敏度高、响应线性范围宽和检出限低等优点，广受国内外研究者的青睐。

碳点(Carbon quantum dots，简称CDs)是近年来发现的一种荧光性质优良的新型碳纳米荧光材料，因具有良好的水溶性、生物相容性和低毒性等优点[10-11]，在离子传感、生物传感、细胞成像等方面得到了广泛研究[12]。目前碳点的合成方法有化学氧化法[13]、水热合成法[14]、微波法[15]、电化学法[16]等，在这些方法中，微波法能够有效缩短反应时间，且具有操作简单，制备成本低，快速便捷等优点，备受研究者关注[17-18]。

本研究以柠檬酸为碳源，尿素为氮源，采用微波一步法快速制备出稳定性高，水溶性好，富含羟基、羧基和氨基的蓝色荧光氮掺杂碳点(N-CDs)，基于多巴胺(DA)可以猝灭N-CDs荧光的特性，建立了一种快速、简便、灵敏的DA检测方法。该方法具有良好的选择性和较宽的检测范围，可用于正常人尿液中多巴胺含量的检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

微波炉(格兰仕集团)；Agilent Cary100紫外可见分光光度计(美国安捷伦科技公司)；F-7000荧光光谱仪(日本日立公司)；pHS-3C型酸度计(上海雷磁仪器公司)；HH-S2 数显恒温水浴锅( 金坛市医疗仪器厂)；TGL-20M型台式高速冷冻离心机(上海卢湘仪离心机有限公司)；Nicolet 5700型傅立叶红外光谱仪(美国Thermo公司)；JEM-2100透射电子显微镜(日本电子株式会社)；ESCALab250 X-射线光电子能谱仪(美国 Thermo公司)；FLS-920光谱仪(英国爱丁堡仪器公司)；DHG-9146A 电热恒温鼓风干燥箱( 上海精宏实验设备有限公司)。

盐酸多巴胺(纯度≥ 99.0%，上海毕得医药科技有限公司)，柠檬酸、尿素(纯度≥ 99.0%，九鼎化学(上海)科技有限公司)。其他所用试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

1.2 氮掺杂碳点的合成

准确称取0.5 g柠檬酸和0.3 g尿素于100 mL锥形瓶中，加水10 mL溶解，置于微波炉中央位置于高火档(700 W)微波3 min，得到棕黑色物质，将棕黑色物质冷却至室温，加水溶解，然后离心10 min( 10 000 r/min)，取上清液用0.22 μm滤膜过滤，再用截留量500 kD的透析袋透析24 h(每3 h换水一次)，除去未反应的柠檬酸和尿素，制得纯净的N-CDs溶液。加适量水稀释配制成浓度为0.3 mol/L的N-CDs母液(以碳计)，储藏于4 ℃冰箱中备用。

1.3 量子产率

1.4 多巴胺的定量检测

在系列5 mL离心管中依次加入0.4 mL N-CDs、0.4 mL B-R缓冲溶液和一定体积的DA标准溶液(0.001 mol/L)或其他干扰物质，用去离子水定容至4 mL，充分混匀后，放入45 ℃的恒温水浴锅中孵育4 h。随后，将离心管从水浴锅中取出，冷却至室温，于荧光光谱仪(λex=360 nm，λem=440 nm)上测定体系荧光强度(IF)，同时做DA 试剂空白(IF0)。

2 结果与讨论

2.1 氮掺杂碳点的表征

透射电镜(TEM，图1A)图显示，N-CDs在溶液中分散性良好，基本呈规则的球形。图1B为N-CDs TEM 图上统计的大约100个碳点的粒径分布图，由该图可知，合成的N-CDs粒径范围为0.5～5 nm，主要分布在2.0～3.5 nm范围内，平均粒径为2.6 nm。图1C为N-CDs的原子力显微镜(AFM)图，由图中可以看出，制备的N-CDs为规则的球形，AB段的平均高度在2.4 nm左右，与TEM的表征结果基本一致。两种表征均在纯水中进行样品制备，未经过进一步的超声处理，说明N-CDs在水中具有很好的分散性。

图1 N-CDs的TEM(A)，粒径分布(B)，AFM(C)图和AFM图中AB段的轮廓高度(D)Fig.1 TEM(A) and particle distribution(B) and atomic force microscope(C) images of N-CDs and profile height of AB section in AFM image(D)

图2 氮掺杂碳点的红外光谱图Fig.2 IR spectrum of N-CDs

图3 N-CDs 的X-射线光电子能谱图(A)和C1s(B)、 O1s(C)、N1s(D)高分辨能谱Fig.3 XPS(A) and C1s(B),O1s(C),and N1s(D) spectra of N-CDs

2.2 氮掺杂碳点的光学性能

对N-CDs进行紫外吸收光谱和不同激发波长下的荧光光谱扫描。N-CDs的吸收曲线从紫外区一直延伸到可见光区，且在240、340 nm处有吸收峰(图4A，曲线a)。240 nm处的吸收峰可能是N-CDs内部π-π*跃迁所致，而340 nm处的吸收峰则可能由N-CDs内部n-π*电子的跃迁所产生[23]。N-CDs在360 nm最佳激发波长(图4A，曲线b)下可发射出455 nm(图4A，曲线c)的荧光。由图4A内插图可看出，N-CDs在日光灯照射下呈透明、均一的淡黄色溶液，而在365 nm的紫外灯照射下发出蓝色荧光。

图4 N-CDs的紫外光谱图(A)和在不同激发波长下的荧光光谱(B)Fig.4 UV-Vis absorption spectrum(A)and fluorescence spectra of N-CDs under different excitation wavelengths insert:photographs of N-CDs solution under daylight(left) and UV light of 365 nm(right)

图4B为不同激发波长(320～410 nm，每次间隔10 nm)下N-CDs的荧光光谱。由图可知，N-CDs荧光发射峰的位置和强度依赖于激发波长。改变激发波长，N-CDs的荧光发射峰和强度均随之改变。随着激发波长由320 nm 增加到410 nm，荧光发射峰逐渐红移，发射波长由441 nm 红移至519 nm，同时荧光强度先增大后减小。N-CDs的这一荧光特性，可能与其表面缺陷[24]及纳米粒子粒径对光的选择性有关[25]。根据N-CDs的荧光强度变化，后续试验选择最佳激发波长为360 nm。以硫酸奎宁(54%，0.1 mol/L H2SO4)为参考物质，测得该N-CDs的荧光量子产率约为5.79%。

2.3 DA测定条件的优化

考察了反应温度、反应时间和pH值对N-CDs测定DA的影响，结果见图5。图5A为在pH 8.0 B-R缓冲溶液中反应4 h后，不同温度对DA猝灭N-CDs荧光的影响。结果显示，常温下DA 对N-CDs的荧光几乎没有猝灭作用，随着温度的升高，荧光猝灭逐渐增强，当温度达45 ℃时，荧光猝灭程度基本达到最高，继续升温，猝灭效率改变很小。因此，实验选择在45 ℃下孵育一定时间后进行荧光测定。

图5B为45 ℃水浴锅中，不同pH值条件下，孵育不同时间后N-CDs-DA 体系的荧光变化情况。结果表明，在pH 7.0条件下，随着时间的增加，N-CDs-DA 体系的荧光强度变化不甚明显。pH 8.0和pH 9.0时，随着时间的增加，N-CDs-DA 体系的荧光强度快速降低，孵育时间超过4 h后，荧光强度下降趋缓，且两种pH值条件下的荧光强度变化趋势基本吻合。当pH 10.0或pH 11.0时，随着时间的增加，N-CDs-DA 体系的荧光强度先迅速降低(且pH值越大，下降越迅速)，后又随着时间的增加缓慢升高(且pH值越大荧光强度增大趋势越明显)，其原因可能是在强碱性环境中，多巴胺容易发生聚合反应形成聚多巴胺[26-27]。因此，实验选择在pH 8.0，孵育温度为45 ℃的条件下，孵育4 h后测定N-CDs-DA 体系的荧光强度。

图5 温度(A)和不同pH值条件下反应时间(B)对N-CDs-DA体系荧光强度的影响Fig.5 Effect of temperature(A) and reaction time under different pH conditions(B) on the fluorescence intensity of N-CDs-DA system

2.4 荧光寿命分析

对N-CDs和N-CDs-DA体系进行荧光寿命测试，并对荧光衰减曲线进行拟合，得到N-CDs猝灭前后的荧光寿命分别为10.20、8.90 ns。这是因为,碱性环境中DA被氧化成多巴胺醌，引起N-CDs荧光猝灭,导致其荧光寿命减弱，进一步证明多巴胺醌引起的荧光猝灭是一种动态猝灭。

2.5 多巴胺对氮掺杂碳点的荧光猝灭及其机理探讨

常温下，DA的加入对 N-CDs 溶液的荧光强度无影响，只有在适宜的碱性条件和一定温度下进行孵育，DA才能有效猝灭N-CDs的荧光。在碱性环境中，DA可被O2氧化生成多巴胺醌，而多巴胺醌是强吸电子体[28]，结合反应前后的荧光寿命分析，认为DA猝灭N-CDs荧光的可能机理是电荷转移。即在一定的温度条件下，DA在碱性环境中被氧化生成多巴胺醌，多巴胺醌的强吸电子结构使得当其与N-CDs相互作用时，N-CDs的激发态电荷转移至多巴胺醌进而引起N-CDs荧光猝灭。N-CDs的合成方案及荧光猝灭原理见图6。

图6 N-CDs的合成方案及荧光猝灭原理Fig.6 Scheme of the synthetic strategy for the N-CDs and the principle of fluorescence quenching

图7 N-CDs对DA的选择性Fig.7 Selectivity of N-CDs to DA

图8 N-CDs荧光强度随DA浓度的变化Fig.8 Fluorescence intensity of N-CDs under diffirent DA concentrations

2.6 氮掺杂碳点对DA的选择性

2.7 N-CDs对DA的检测

考察了B-R缓冲溶液(pH 8.0)中不同浓度的DA 对N-CDs 荧光强度的影响，结果如图8所示。在0～100 μmol/L范围内，随着DA浓度的增大 ，N-CDs的荧光强度逐渐减弱，发生不同程度的荧光猝灭，当DA浓度为100 μmol/L时,其荧光猝灭率超过50%；在2.5～37.5 μmol/L范围内，DA浓度与N-CDs 的荧光猝灭效率(IF/IF0)呈线性关系，线性方程为IF/IF0=-0.008 1cDA+0.936 1，r2=0.993 2，检出限(3σ/k)为0.08 μmol/L。

2.8 实际样品测定

为进一步研究方法的实用性，实验取志愿者尿液用B-R缓冲液( pH 8.0)稀释5倍，取稀释后的尿液2.0 mL，按DA测定方法[29]进行多巴胺的回收率测定，结果见表1。由表1可知，其加标回收率为99.5%～106%，相对标准偏差(RSD)为1.8%～2.3%。测定结果的方法回收率和RSD均在可接受范围内，说明此方法准确度高，可应用于实际样品的分析。

2.9 与其他方法的比较

将本方法的检测结果与其他文献方法进行比较，结果如表2所示。从表2可以看出，本方法的检测性能与文献报道的比色分析法、电化学分析法和荧光光度法相当，具有线性范围宽、检出限较低等优点。

表1 加标回收实验结果(n=6)Table 1 Results of recovery test(n=6)

表2 与其他多巴胺检测方法的对比Table 2 Comparison with other methods for determination of dopamine

3 结 论

以柠檬酸为碳源，尿素为氮源，采用微波一步法合成了水溶性好，富含—OH、—COOH和—NH2等官能团的氮掺杂碳点，所制备的N-CDs对溶液中的DA具有良好的选择性、灵敏性和抗干扰能力，基于此建立了一种新的、快速检测DA的方法。该方法的检出限达0.08 μmol·L-1。应用于实际样品尿液中DA含量的检测，其加标回收率为99.5%～106%，RSD为1.8%～2.3%。该方法灵敏，简单，易操作，在实际生物样品中DA含量的检测方面具有一定的应用前景。