IgG1型单克隆抗体对照品的一级结构解析

崔新玲，胡志上，孟晓光，钱小红，朱 涛，应万涛*

(1.天津科技大学 生物工程学院，天津 300457；2.北京蛋白质组研究中心 蛋白质组学国家重点实验室，国家蛋白质科学中心(北京)，北京 102206；3.中国计量科学研究院，北京 100013；4.北京正旦国际科技有限责任公司，北京 102206；5.天津康希诺生物股份有限公司，天津 300457)

21世纪以来，单克隆抗体的研发技术快速发展，推进了其在生物医学研究、生物制药以及临床治疗中的应用[1]。单克隆抗体药物(mAb)是通过基因工程生产的蛋白质药物，具有特异性高、作用机制明确、效果显著、经济效益大等优势，已成为近年来生物医药产业的重要增长点。与小分子药物不同，抗体类药物不仅分子质量大[2]，结构复杂，而且可经糖基化或其它翻译后修饰[3]，导致其结构具有高度不均一性(异质性)[3-4]，这对单克隆抗体类药物的表征分析和质量控制提出了新的要求和挑战。

先进的分析方法，比如质谱技术[5-11]，可提供非常详细的表征过程和产品信息[5,12-13]，其提供的丰富的结构信息对产品质量至关重要，而这些技术自身的准确性、精确性、稳健性和适用性也同样重要。产品质量标准是根据产品而设定的，并且要持续适用于内部参考标准品[14]。具有代表性且应用广泛的mAb标准品[15-17]，加之详细的表征数据，可极大地保证整个药品生命周期中的质量控制[18-23]。本文主要对中国计量科学研究院提供的抗体对照品(IgG1型单克隆抗体)的关键参数进行研究分析(主要是一级结构)，为后续进行深入的质量研究与计量学溯源技术标准提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

L-3120高效液相色谱仪(北京Rigol公司)，Exactive Plus EMR质谱仪(美国Thermo公司)，CEInfinite C01全柱成像毛细管电泳(加拿大AES公司)，6600 TripleTOF®(美国Sciex公司)，C4反相色谱柱(日本Shiseido公司)，SEC分子排阻色谱柱(日本Tosoh公司)，C18反相色谱柱(美国Agilent公司)，阳离子交换色谱柱SCX(美国Sepax公司)。

IgG1型单克隆抗体(中国计量科学研究院)。甲酸(FA)、乙腈(ACN)、三氟乙酸(TFA)、碳酸氢铵、碘乙酰胺、胰蛋白酶(Trypsin)、二硫苏糖醇(DTT)均为质谱级，购自美国Sigma公司。PNGaseF酶(质谱级，美国Promega公司)。两性电解质HR AESlyte 3-10、SH AESlyte 2.5-5、羧甲基纤维素(MC)、阴极电极液氢氧化钠、阳极电极液磷酸、等电点标准品(7.03)、等电点标准品(9.33)均为色谱级，购自于加拿大AES公司。磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、盐酸胍均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 mAb的分子量分析

完整分子量分析：将蛋白溶液稀释至1 mg/mL，高速离心后，取5 μg样品进行反相液相色谱-质谱分析。采用C4色谱柱进行蛋白质脱盐和在线分离。流动相A：98%H2O，2%ACN，0.1%FA；流动相B：90%ACN，10%H2O，0.1%FA。检测波长：280 nm。流速：0.2 mL/min。梯度条件：0～3.0 min，2%～30%B；3.0～10.0 min，30%～90% B；10.0～13.0 min，90%B；13.0～15.0 min,90%～2% B；15.0～20.0 min，2%B。质谱条件：采集范围:m/z1 000～9 000;正离子模式；最大离子注入时间:200 ms。

完整切糖分子量分析：取样品10 μg，按酶∶蛋白1∶50(U ∶μg)加入PNGaseF酶切糖，取5 μg样本进行反相液相色谱-质谱分析。方法同上。

还原后分子量分析：取样品100 μg(1 mg/mL)，加入DTT 进行还原，以10 000 g高速离心后取5 μg样本进行体积排阻色谱-质谱分析。采用SEC色谱柱，流动相：80%H2O，20%ACN，0.1%TFA，0.1%FA。检测波长：280 nm，流速：0.2 mL/min。等度洗脱20 min。质谱条件同完整分子量分析。

切糖还原后分子量分析：取样品10 μg，按酶∶蛋白1∶50(U∶μg)加入PNGaseF酶进行切糖处理，再加入DTT 进行还原，以10 000 g高速离心后取5 μg进行体积排阻色谱-质谱分析，实验分析方法同“还原后分子量分析”。

采用Protein Deconvolution(v4)(Thermo Fisher)软件进行分析。其中Rel.Abundance Threshold(%)：0%～1%；m/zRange：Min 1 000；Max 6 000。

1.3 电荷异质性分析

全柱成像实时等电聚焦毛细管电泳：将样品稀释至10 mg/mL，并取样品5 μL与HR AESlyte 3-10(1 μL)、SH AESlyte 2.5-5(3 μL)、0.5% MC(40 μL)、等电点标准品(7.03)(0.5 μL)、等电点标准品(9.33)(0.5 μL)混匀，之后以10 000 g离心2 min，单次进样体积5 μL。仪器参数：柱温25 ℃；阴极电极液：0.1 mol/L NaOH；阳极电极液：0.08 mol/L H3PO4；检测波长280 nm。聚焦程序：1 000 V，1 min；2 000 V，1 min；3 000 V，4 min。温度：25 ℃，电流：<15 μA。

离子交换色谱：以去离子水将样品稀释至1 mg/mL，高速离心后取10 μg进样。A相：10 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.0)；B相：A+0.5 mol/L NaCl(pH 6.0)，检测波长：280 nm，流速0.6 mL/min。采用SCX色谱柱。梯度洗脱：0～5.0 min，0%B；5.0～43.0 min，0～25%B；43.0～43.5 min，25%～90%B；43.5～48.5 min，90%B；48.5～55 min，90%～0% B；55～60 min，0%B。

1.4 肽图分析

还原肽图：将样品以50 mmol/L碳酸氢铵稀释至1 mg/mL，取100 μL加入6 mol/L盐酸胍，加入1 mol/L DTT使其浓度为20 mmol/L，56 ℃还原1 h，加入1 mol/L IAA至其终浓度为25 mmol/L，室温避光反应1 h。使用脱盐柱除盐。以酶与蛋白1∶30(质量比)的比例加入胰蛋白酶，37 ℃酶解16 h，加入FA至其终浓度为0.1%(体积分数)，终止反应。取酶切液进行HPLC/UV及ESI-MS/MS分析。

切糖还原肽图：将样品以50 mmol/L的碳酸氢铵稀释至1 mg/mL，取100 μL，按照1∶30(U∶μg)的比例加入PNGaseF酶，37 ℃孵育16 h，然后进行变性还原烷基化及胰蛋白酶酶切(同还原肽图实验条件)。

液相色谱条件：A：95%H2O，5%ACN，0.1%FA；B：95%ACN，5%H2O，0.1%FA。流速：0.3 mL/min。检测波长214 nm。0～5.0 min，2%B；5.0～103.0 min，2%～45%B；103.0～108.0 min，45%～90% B；108.0～113.0 min，90%B；113.0～115.0 min,90%～2%B；115.0～120.0 min，2%B。

使用AB SCIEX的BioPharma View进行数据库检索。

2 结果与讨论

2.1 完整分子量分析

质谱电喷雾离子化源(ESI)可以使完整抗体蛋白带多个电荷，从而将质荷比(m/z)降至质谱仪可监测的范围内。而对带多电荷的蛋白质谱谱图进行去卷积处理是完整蛋白质分子量测定的首选方法，其与高分辨率质谱仪一起使用时，可区分mAb糖型与其它翻译后修饰(PTM)。在进入质谱仪之前，色谱分离可用于提高基于MS的完整检测的通量和灵敏度。反相高效液相色谱(RP-HPLC)和尺寸排阻色谱(SEC)都已成功用于完整的mAb分离检测[14，18]。本研究将上述方法应用于抗体对照品的分析中，并将实测的分子量与理论分子量进行比较。

mAb的完整分子量解析如表1及图1所示。图1A显示，mAb完整蛋白所带电荷状态良好。综合表1和图1B可知，mAb的主峰(4号峰)是重链上携带的两个G0F；部分重链(5号峰)含有G0F/G1F，相对比例为18.3%；小部分抗体两条重链(6号峰)携带G1F糖型，其比例为3.1%。相对比例为6.9%的重链(2号峰)携带G0F/G0F(G0F掉一个HexNAc)，极少部分(1.4%)重链(1号峰)携带的G0F/G0F掉2个HexNAc。可见此抗体的主要糖型是G0F与G1F。3号峰未解析出，从图1B插图可得，其匹配的是主峰的部分，即此峰为主峰的一部分，此现象可能是去卷积ReSpect算法导致的。

表1 mAb完整分子量分析结果表Table 1 Intact molecular weght(MW) analysis of mAb

ND：no detection

图2结果提示此抗体对照品切糖后分子量为145 810.4，与理论分子量145 806.0的相对误差为44 ppm，两者基本一致，说明在完整切糖水平抗体序列正确。通过以上对完整分子量的解析，得出抗体的实测分子量分布和抗体的糖型分布情况，并计算出N糖含量为1.67%～2.15%(表2)。

图1 mAb完整分子量解析图谱Fig.1 Intact molecular weight analysis of mAbA.multi-charge spectrum，number 32-45,47 were electric charges;B.deconvoluted spectrum

图2 mAb去糖后的分子量解析图谱Fig.2 Molecular weight analysis of mAb after PNGaseF digestedA.multi-charge spectrum,number 32-46 were electric charges;B.deconvoluted spectrum

ProteoformIntactMWMWafterPNGaseFdigestedGlycosylatedcontent/%G0F/G0F-2HexNAc148285.0145810.41.67G0F/G0F-HexNAc148493.6145810.41.81G0F/G0F148697.3145810.41.94G0F/G1F148856.9145810.42.05G1F/G1F149020.8145810.42.15

2.2 还原分子量解析

使用Protein Deconvolution进行去卷积分析，数据的置信区间设置为99%。mAb还原后重链主峰比例为100%，分子特征为重链携带一个G0F；mAb还原后轻链主峰比例为100%，与理论分子量一致。如图3A所示。

mAb切糖后，分子量减小了1 443.4(G0F)，还原重链主峰比例为100%，与理论分子量一致。mAb切糖后还原轻链主峰比例为100%，与理论分子量一致。如图3B所示。

2.3 电荷异质性结果

抗体类产品的翻译后修饰(如糖型的影响及末端赖氨酸的影响)可导致其电荷异质性，而某些电荷异质性由于对单抗稳定性及其生物学功能的发挥具有重要的影响而成为关键质量属性(CQA)，且电荷异质性可直接反映其生产工艺的稳定性，受到生物技术产业界及监管机构密切关注，也是抗体类药物放行必检项目之一。

全柱成像实时等电聚焦毛细管电泳(WCID-cIEF)的等电点结果如图4A所示，抗体等电点的分布(表3)范围为8.21～8.74。主峰(Peak 4)的等电点为8.61，相对含量为61.43%，重复实验变异系数(CV%)差异较小，相对标准偏差(RSD)为0.08%。检出3个酸性峰Peak 1、2、3，其等电点分别为8.21、8.35、8.46；检出1个碱性峰(Peak 5)，其等电点为8.74。实验重复性好(未附)，结果可信。离子交换色谱图谱及分析见图4B及表4，mAb由于C末端无K，所以碱性峰(Peak 5、6)含量较低(4.1%)，而酸性峰(Peak 1、2、3)相对较高(23.9%)，主峰(Peak 4)的相对含量为72.0%，重复实验结果一致(未附)。离子交换色谱结果与等电点结果相吻合，进一步验证了方法的可靠性。

图3 还原分子量解析图Fig.3 Reducing molecular weight analysis chartA.the molecular weight distribution after DTT reduction,B.the molecular weight distribution of DTT reduction after PNGaseF digested；R:reduce,HC:heavy chain,LC:light chain,P:PNGaseF

图4 mAb的等电点分布(A)及离子交换色谱图(B)Fig.4 Distribution of pI(A) and ion exchange chrometographic spectrum(B) of mAb

表3 mAb的等电点分布Table 3 pI distribution of mAb

表4 mAb的离子交换色谱图谱解析Table 4 Ion exchange chromatography spectrum analysis of mAb

2.4 肽图结果

肽图是一种强大的分析手段，可提供抗体序列覆盖度及抗体的位点特异性信息，基于质荷比、MS/MS碎裂模式和保留时间，LC-MS可进一步确定肽图中的所有峰。肽图常用于检测样品的长期稳定性，如修饰(例如氧化、脱酰胺、剪切)和PTM(如糖基化)等。

此IgG1型抗体对照品的重链(HC)序列覆盖率达87.4%，轻链(LC)序列实现100%覆盖。其中重链由于中间有一段较长的序列没有胰蛋白酶的酶切位点，且超过质谱的扫描范围，故未覆盖到。在肽图分析中检测到的糖型与分子量分析中检测到的所有糖型一致，主要为G0F与G1F，糖肽表现在Fc区的EEQYNSTYR为中心的肽段上，提示糖位点在NST的天冬氨酸残基上(图5)。图5中方框内为检测到的糖肽片段。同时进行了抗体还原烷基化胰蛋白酶酶切与完整抗体胰蛋白酶酶切，成功解析出了二硫键的位点(图6)及二硫键肽[16-19]。在抗体甲硫氨酸(M)的氧化分析中检测到M34、M83、M257、M363及M433的氧化修饰，其中M83位点的氧化修饰率最高，为2.1%，与已报道的抗体氧化率一致[24]。由于抗体C末端的糖化主要发生在抗体C末端的Lys残基上[25-29]，而此对照抗体C末端K缺失，故未检测到抗体C末端的糖化情况。

最终根据以上的分析结果及抗体的理论氨基酸序列得出抗体的结构，如图6所示。人源化IgG1的轻(L)和重(H)链结构域标记为可变区(V)和恒定区(C)，以及从N-末端开始的不同结构域。

图5 抗体切糖前(A)后(B)的肽图Fig.5 Peptide mapping before(A) and after(B) PNGaseF digested

图6 抗体结构图
Fig.6 Structure of the reference antibody the black line indicates the intrachain and interchain disulfide bond,and the cysteine residue number is the position appearing in the light chain or heavy chain sequence from the N-terminus

3 结 论

mAb的分子量大，完整分子/还原亚基、切糖前后的分子量分析是非常必要的[30]。本文在分子量的检测中，从各个方面验证了抗体对照品序列的正确性及其相应的糖型修饰，为后续多批次批间一致性分析提供了参考。通过全柱成像毛细管电泳及离子交换的方法表征了抗体对照品的电荷异构体分布情况，两种方法检测结果一致，证明了本方法的可信度。但电荷异构体的不同峰形成的具体原因，需进一步深入研究。通过肽图分析获得了抗体的序列覆盖率、糖肽分布及其糖位点[31]的准确信息，实现了互补决定区(CDR)肽段的分析检测[32]、二硫键解析及甲硫氨酸(M)氧化修饰率分析，并关注了抗体C末端的糖化现象。上述分析流程，成功实现了抗体对照品的一级结构研究，为进一步深入研究奠定了基础。