超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱快速筛查染发剂中32种染料成分

鞠玲燕,李兆杰*,宋卫得,徐成钢,崔 嘉

(1.威海海关，山东 威海 264205；2.日照海关，山东 日照 276800)

氧化型染发剂因效果好且颜色持久被广泛应用，但这类染发剂含有芳香胺类和酚类染料成分，这些组分长期使用具有不同程度的致癌、致畸和致敏性[1-3]。鉴于氧化型染发剂的安全性问题，我国《化妆品安全技术规范(2015年版)》明确规定了染发剂中禁限用染料组分的类别及其使用限量，并发布了高效液相色谱法用于分析对苯二胺等32种染料，加强染发剂中染料成分安全性的监测。文献中也建立了其他检测方法，但是这些方法存在一些不足，如采用液相色谱法[4-9]、气相色谱-质谱联用法[10]所覆盖的染料种类有限，涉及多种染料成分时往往需多个检测系统，且对复杂基质的抗干扰能力不足；液相色谱-质谱联用法[11-15]虽具有分离度高、特异性强等优点，但因其反应模式的限制，无法同时在正负离子模式下检测，检测时需建立正负两个检测系统，且质谱参数优化过程比较繁琐。本研究克服以上方法的不足，以苯二胺等32种禁限用染料为对象，建立了超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法同时测定染发剂中多种染料成分的快速筛查和定量分析方法。本方法通过正负离子同时扫描模式，仅需一个系统即可实现32种染料组分的有效分离，18 min内完成检测；直接采用一级母离子精确质量数获得定性和定量结果，且无需优化碰撞能，质谱参数优化过程也大大简化；利用梯度碰撞能自动触发获得的丰富的二级碎片离子对定性结果进行确证，避免了假阳性出现的几率，提高了定性的准确性。该方法方便、快捷、高通量、灵敏度高、特异性好，可同时对染发剂中多种染料成分进行测定，保证染发剂质量安全。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪Q-Exactive(美国ThermoFisher公司)；CR22GⅡ高速冷冻离心机(日立公司)。

32种染料成分标准品纯度均>95%;间苯二酚、甲苯-2，5-二胺硫酸盐、对苯二胺、对氨基苯酚、间氨基苯酚、4-氯间苯二酚、邻苯二胺、邻氨基苯酚、2-硝基对苯二胺、甲苯-3，4-二胺、N，N-二乙基甲苯-2，5-二胺盐酸盐、对苯二酚、2，6-二氨基吡啶、N，N-二乙基对苯二胺硫酸盐、1-萘酚购自德国Dr.Ehrenstorfer公司；2-氨基-3-羟基吡啶、4-氨基-2-羟基甲苯、2，4-二氨基苯氧基乙醇盐酸盐、N，N-双(2-羟乙基)对苯二胺硫酸盐、2-氯对苯二胺硫酸盐、苯基甲基吡唑啉酮、4-氨基-3-硝基苯酚、4-硝基邻苯二胺、对甲基氨基苯酚硫酸盐、6-羟基吲哚、N-苯基对苯二胺、2，7-萘二酚、1，5-萘二酚购自上海安谱公司；2-甲基间苯二酚、6-氨基间甲酚、4-氨基间甲酚购自德国CNW公司；间苯二胺购自美国Accustandard公司。甲醇(色谱纯，美国默克公司)；正己烷、乙酸铵(色谱纯，德国CNW公司)；抗坏血酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。

标准储备液：甲苯-2，5-二胺硫酸盐和2-氯对苯二胺硫酸盐采用2 g/L抗坏血酸水溶液配制；2-硝基对苯二胺、甲苯-3，4-二胺采用甲醇配制，其余染料均采用甲醇-2 g/L抗坏血酸水溶液(体积比50∶50)配制；标准工作液采用甲醇-2 g/L抗坏血酸水溶液(体积比50∶50)配制，储存于4 ℃冰箱于2 d内使用。

1.2 色谱-质谱条件

1.2.1 色谱条件色谱柱：Eclipse Plus C18(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)；流速：0.3 mL/min；柱温：30 ℃；进样体积：5 μL；流动相：A为甲醇，B为5 mmol/L的乙酸铵水溶液。梯度洗脱程序：0～1 min，10% A；1～6 min，10%～50% A；6～12 min，50%～80% A；12～14 min，80% A；14～15 min，80%～10% A；16～18 min，10% A；总分析时间：18 min。

1.2.2 质谱条件喷雾电压：正离子模式3.5 kV，负离子模式3.0 kV；离子源温度：350 ℃；金属毛细管温度：320 ℃；鞘气压力：35 arb；辅助气压力：15 arb；扫描范围(m/z)：50～750 Da；一级质谱全扫描(Full scan)分辨率：R=70 000；AGC target：3e6；最大注入时间：100 ms；数据依赖二级离子全扫描(Full MS/ddMS2)分辨率：R=17 500；归一化碰撞能：20、45、70 eV；AGC target：e5；最大注入时间：50 ms；动态排除：10 s。32种染料的质谱信息见表1。

1.3 样品前处理

氧化型染发剂一般包括染发组分(1剂或A剂)和显色组分(2剂和B剂)两剂，检测时准确称取1剂或A剂染发剂、染发霜或染发焗油等染发组分0.25 g(精确至0.000 1 g)至50 mL离心管中，加入25 mL甲醇-2 g/L抗坏血酸水溶液(体积比50∶50)，涡旋1 min，超声提取15 min，取3 mL提取液，加入3 mL正己烷，涡旋1 min，以8 000 r/min离心5 min，移取下层清液过0.22 μm微孔滤膜，上机检测。根据样品中染料含量，检测时可取处理后的样品溶液适当稀释至所需的质量浓度。

表1 32种染料组分的CAS号、分子式、离子类型、保留时间和精确质量数Table 1 CAS no.,molecular formula,ion formation,retention time and theoretical accurate mass of the 32 dyes

2 结果与讨论

2.1 样品前处理

2.1.1 提取溶剂的选择由于氧化型染发剂中很多染料组分易氧化，因此在配制标准溶液和提取过程中加入抗坏血酸来提高其稳定性；另外，因染料性质不同，一些染料成分在极性溶剂中具有较好的溶解性，而个别染料成分(如甲苯-2，5-二胺硫酸盐和2-氯对苯二胺硫酸盐等)在水中具有较好的溶解性。因此，实验考察了甲醇-2 g/L抗坏血酸水溶液(50∶50)、乙腈-2 g/L抗坏血酸水溶液(50∶50)和乙醇-2 g/L抗坏血酸水溶液(50∶50)为提取试剂时待测物的提取效率和提取体系的稳定性。结果显示，以乙腈-2 g/L抗坏血酸水溶液提取时，甲苯-2，5-二胺硫酸盐、2，4-二氨基苯氧基乙醇盐酸盐、N，N-双(2-羟乙基)对苯二胺硫酸盐均出现了溶剂效应；以乙醇-2 g/L抗坏血酸水溶液提取时，甲苯-2，5-二胺硫酸盐、2，4-二氨基苯氧基乙醇盐酸盐、N，N-双(2-羟乙基)对苯二胺硫酸盐和2-氨基-3羟基吡啶峰形不佳，溶剂效应严重；而采甲醇-2 g/L抗坏血酸水溶液提取时32种染料的色谱峰形均较好(图1)，不存在严重的溶剂效应，完全满足实验要求。因此，实验采用甲醇-2 g/L抗坏血酸水溶液(50∶50)为提取溶剂。

图1 32种染料组分的提取离子色谱图Fig.1 Extracted ion chromatograms of the 32 dyes the peak 1-32 were as same as those in Table 1

2.1.2 净化溶剂的选择氧化型染发剂在配方中会添加较多油脂类物质，直接采用极性溶剂超声的样品前处理方法，较难去除样品中的油脂类物质，还会降低色谱柱的使用寿命及质谱响应。因此，本实验利用常见弱极性溶剂正己烷除去样品基质中的油脂类物质，以达到净化样品的目的。

2.2 色谱条件的优化

实验考察了Eclipse Plus C18(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)超高效色谱柱和普通的C18色谱柱对待测物的分析效果。结果显示，与传统液相色谱法相比，超高效色谱柱对各待测物分离效果好，可在较短的时间内实现32种染料成分中7对同分异构体(间苯二酚和对苯二酚；甲苯-3，4-甲苯-2，5-二胺硫酸盐和甲苯3，4-二胺；对苯二胺、间苯二胺和邻苯二胺；对氨基苯酚、间氨基苯酚和邻苯二胺；4-氨基间甲酚、对甲基氨基苯酚硫酸盐、4氨基-2-羟基甲苯和6氨基间甲酚；2-硝基对苯二胺和4-硝基邻苯二胺；2，7-萘二酚和1，5-萘二酚)的良好分离，显著提高了同分异构体目标物定性和定量分析的准确性。另外，不同流动相对分析结果的影响显示，有机相采用甲醇的分离效果和信号强度优于乙腈，且当流动相中加入5 mmol/L乙酸铵后，可兼顾正负离子模式的各种染料组分的信号强度，故采用甲醇-5 mmol/L的乙酸铵作为流动相。优化后的色谱条件见“1.2.1”所述，各染料组分在18 min内获得较好的分离效果和较理想的峰形。

2.3 质谱条件的优化

本研究采用高分辨质谱的一级质谱全扫描加数据依赖的二级质谱扫描方式，对目标检测物进行定性筛查和确证。为了兼顾所有待测物，采用正负离子切换方式同时进行分析，检测时无需采用多个检测系统多次检测，缩短了检测时间。在正负离子模式下分别提取32种染料组分的一级母离子精确质量数，发现间苯二酚、4-氯间苯二酚、2-甲基间苯二酚、4-氨基-3-硝基苯酚、对苯二酚、2，7-萘二酚、1，5-萘二酚、1-萘酚8种染料组分在负离子模式下响应强度高，离子干扰少，其母离子均为[M-H]-；而其他染料组分在正离子模式下响应强度高。在正离子模式的染料组分中，甲苯-2，5-二胺硫酸盐、N，N-双(2-羟乙基)对苯二胺硫酸盐、2-氯对苯二胺硫酸盐、对甲基氨基苯酚硫酸盐和N，N-二乙基对苯二胺硫酸盐的母离子均为[M-H2SO4+H]+；2，4-二氨基苯氧基乙醇盐酸盐母离子为[M-2HCl+H]+；N，N-二乙基甲苯-2，5-二胺盐酸盐的母离子为[M-HCl+H]+，其余均为[M+H]+。通过正负离子切换全扫描模式确定目标物离子类型、母离子的精确质量数和保留时间(见表1)。使用高分辨质谱检测目标化合物的精确质量数对于同时准确定性和定量非常重要，因此必须保证质谱数据具有良好的质量准确度。表2列出的32种目标物的母离子质量准确度误差均小于10 ppm，可见检测物的质量准确度均很好，可满足定性定量需求。

通过全扫描获得目标化合物母离子精确质量数，根据获得的精确质量数设定目标物列表，仅在一级质谱扫描时发现列表中的母离子，且其强度达到设定阀值时，即自动进行二级质谱扫描。设定高、中、低3个碰撞能量(20、45、70 eV)对目标物进行碰撞，最终加和获得丰富的二级碎片离子(见表2)。分析结果既有母离子的精确质量数，又有二级碎片离子信息，提高了定性的准确性，显著降低了假阳性出现的几率。此外，高分辨质谱以母离子作为定量离子，且直接采用梯度设置碰撞能，简化了质谱参数的优化，节省了样品分析前的准备时间，更利于样品的快速筛查和定量分析。

表2 32种染料组分的质量准确度误差和碎片离子Table 2 Mass accuracy error and fragment ions of the 32 dyes

(续表2)

No.CompoundTheoreticalaccuratemass(m/z)Measuredaccuratemass(m/z)Massaccuracyerror(ppm)Fragmentions(m/z)132-Aminophenol110.06004110.060070.2792.04948,83.04914142-Nitro-1,4-phenylenediaine154.06110154.06099-0.71119.04780,108.06820153,4-Diaminotoluene123.09167123.091901.87106.06513,79.05423162-Methylresorcinol123.04515123.04476-3.1795.01385,79.05532176-Amino-m-cresol124.07569124.075871.45106.06513,79.0542318Edaravone175.08659175.08614-2.57133.07602,106.06513194-N,N-Diethyl-2-methyl-p-phenylenediaminemonohydrochloride179.15428179.15398-1.67151.12298,136.09950204-Amino-3-nitrophenol153.03057153.02934-8.04122.02475,78.0349221m-Phenylenediamine109.07602109.076141.1093.04472,80.0494822Hydroquinone109.02950109.02891-5.4165.03967,67.01894234-Amino-m-cresol124.07569124.075871.45109.05222,79.05423244-Methylaminophenolsulfate124.07569124.075891.61109.05222,80.04948254-Nitro-o-phenylenediamine154.06110154.06100-0.65137.05836,108.06820262,6-Diaminopyridine110.07127110.071300.2793.04472,66.0338327N,N-Diethyl-p-phenylenediaminesulfate165.13863165.13817-2.79136.09950,121.07602286-Hydroxyindole134.06004134.05975-2.16107.04914,92.04948292,7-Dihydroxynaphthalene159.04515159.04442-4.59115.05532,131.05024304-Aminodiphenylamine185.10732185.107450.7093.05840,108.08187311,5-Dihydroxynaphthalene159.04515159.04445-4.40130.04241,103.05532321-Naphthol143.05024143.04951-5.10115.05532,79.01894

2.4 方法学验证

2.4.1 线性范围与检出限用甲醇-2 g/L抗坏血酸水溶液(50∶50)配制32种染料的混合标准系列溶液，在优化条件下测定，以染料的色谱峰面积(Y)为纵坐标，对应质量浓度(X，μg/L)为横坐标绘制标准曲线。采用向空白样品中逐级降低加标浓度至仪器能够定量检出的最低加标浓度为方法定量下限(LOQ)。结果表明，32种染料组分在相应的浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数(r2)不低于0.997 2，LOQ为0.2～40 μg/g，可满足检测要求(表3)。该方法较《化妆品安全技术规范(2015年)》中收录的液相色谱法灵敏度和特异性更好，能对染发剂中的染料成分进行更好的监测。

表3 32种染料组分的线性范围、相关系数、定量下限、平均回收率和相对标准偏差(RSD,n=6)Table 3 Linear ranges,correlation coefficients,LOQs,average recoveries and the relative standard deviations(n=6) of the 32 dyes

(续表3)

No.CompoundLinearrange(μg/L)r2LOQ(μg/g)Spiked(μg/g)Averagerecovery(%)RSD(%)204-Amino-3-nitrophenol100～40000.99801010,50,10099.6,94.0,98.36.9,7.5,5.221m-Phenylenediamine4～10000.99930.40.4,2.0,4.089.1,90.3,95.59.2,8.7,7.822Hydroquinone400～40000.99954040,200,400108,99.4,1059.6,7.6,8.8234-Amino-m-cresol10～10000.99991.01.0,5.0,1093.1,88.3,95.97.8,9.2,6.5244-Methylaminophenolsulfate2～4000.99970.20.2,1.0,2.085.4,89.5,90.49.3,9.1,7.8254-Nitro-o-phenylenediamine40～20000.99734.04.0,20,4092.5,97.4,1008.2,7.4,5.2262,6-Diaminopyridine2～4000.99860.20.2,1.0,2.088.4,96.9,1029.9,8.0,8.127N,N-Diethyl-p-phenylenediaminesulfate4～10000.99930.40.4,2.0,4.098.6,108,99.37.3,7.9,6.0286-Hydroxyindole100～40000.99811010,50,10099.2,104,99.07.1,6.5,5.3292,7-Dihydroxynaphthalene40～20000.99814.04.0,20,40105,101,1088.9,7.5,4.8304-Aminodiphenylamine2～4000.99880.20.2,1.0,2.093.1,88.3,95.99.0,9.5,7.0311,5-Dihydroxynaphthalene10～10000.99721.01.0,5.0,1089.4,99.9,96.09.8,9.0,5.8321-Naphthol40～20000.99964.04.0,20,4098.9,99.4,1068.8,7.0,5.1

content of dye components in hair dyes(μg/g)=mass concentration of components to be measured from standard curve(μg/L)*dilution multiple/1 000(染发剂中染料组分的含量(μg/g)=从标准曲线上得到的待测组分的质量浓度(μg/L)*稀释倍数/1 000)

2.4.2 回收率及精密度由于氧化型染发剂中均含有几种染料成分，因此很难获得针对32种染料成分的空白样品，因此进行方法学验证时，首先对市售染发剂进行了32种成分的检测，选出2种染发剂作为空白样品，一种染发剂除含有2-氨基-3-羟基吡啶和2，4-二氨基苯氧基乙醇盐酸盐外不包含其余30种染料成分(6#样品)，采用该染发剂对不含有的30种染料组分进行方法学验证；同时选择不含有2-氨基-3-羟基吡啶和2，4-二氨基苯氧基乙醇盐酸盐的另一种染发剂(5#样品)，对这2种组分进行方法学验证。选取上述染发剂空白样品，分别添加低、中、高3个浓度水平的混合标准溶液，按“1.3”方法进行前处理，每个水平重复测定6次，计算其回收率和相对标准偏差(RSD)，结果见表3。32个染料的平均回收率为81.0%～110%，RSD为3.3%～9.9%，表明方法具有较好的回收率和重复性。

2.5 实际样品的检测

对8种市售染发剂在优化条件下采用本方法测定，共检出10种染料成分(表4)，检出含量均小于《化妆品安全技术规范(2015年版)》中的限量要求，与样品标示的染料组分相同。8种染发剂中除6#染发剂以外，其余均含有间苯二酚、对苯二胺和甲苯-2，5-二胺硫酸盐等多种致癌或致敏性强的染料组分。6#染发剂中2-氨基-3-羟基吡啶和2，4-二氨基苯氧基乙醇盐酸盐的色谱图和二级质谱图见图2。

表4 8种染发剂中染料成分的测定结果Table 4 Analytical results of 32 dyes in 8 oxidative hair dyes

3 结 论

本研究建立了超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱快速定性筛查和定量分析染发剂中32种染料成分的方法。该方法简单、快速、灵敏，无需繁琐的质谱参数优化过程，采用正负离子模式同时扫描，仅一次检测即可同时分析32种染料组分，并能准确定性定量，适用于染发剂中染料的快速筛查测定，有助于染发剂质量安全监管。

图2 6#染发剂中2-氨基-3-羟基吡啶和2，4-二氨基苯氧基乙醇盐酸盐的色谱图和二级质谱图Fig.2 Chromotography and two-stage full mass scan spectrum of 5-amino-o-cresol and 2，4-diaminophenoxyethanol dihydrochloride in 6# dyesA.chromotography of 5-amino-o-cresol;B.two-stage full mass scan spectrum of 5-amino-o-cresol;C.chromotography of 2，4-diamino-phenoxyethanol dihydrochloride;D.two-stage full mass scan spectrum of 2，4-diaminophenoxyethanol dihydrochloride