高效液相色谱法测定脂肪中11种苯并咪唑类药物残留标志物

邵琳智，邹 游，陈思敏

(广东检验检疫技术中心，广东 广州 510623)

苯并咪唑类(Benzimidazoles，BMZs)药物由于特殊的化学结构而具有良好的生物活性[1]，是一种广谱、高效的驱虫药，广泛用于治疗猪、牛、羊消化道寄生虫病[2]。作为寄生蠕虫疾病治疗的首选药物，苯并咪唑类药物发展非常迅速[3]，随之也带来了许多潜在风险。研究表明，苯并咪唑类药物具有致畸与致突变作用，其亚砜化物、羟化产物等代谢物具有胚胎毒性[4]，因此许多国家将该类药物及其代谢物同时列为牛、羊、猪的肌肉、脂肪、肝、肾以及禽肉、禽蛋和奶中的限用物质进行监控。

我国最新制定的食品安全国家标准《动物性食品中兽药最大残留限量》(征求意见稿)[5]对农业部

235号公告[6]进行修订，其中苯并咪唑类药物增至9种，对其残留标志物亦作了较大修改。规定非班太尔、芬苯达唑、奥芬达唑的残留标志物为芬苯达唑、奥芬达唑和奥芬达唑-2-氨基砜的总和；奥苯达唑的残留标志物为奥苯达唑；噻苯达唑的残留标志物为噻苯达唑和5-羟基噻苯达唑；三氯苯达唑的残留标志物为三氯苯达唑酮；阿苯达唑的残留标志物为阿苯达唑-2-氨基砜；氟苯达唑的残留标志物为氟苯达唑；甲苯达唑的残留标志物为2-氨基-5-苯甲酰基苯并咪唑和5-羟基甲苯达唑。修改后的残留标志物增至11种，与食品法典委员会(CAC)和欧盟的苯并咪唑类药物最大残留限量要求基本一致。

该征求意见稿[5]规定阿苯哒唑的残留标志物在脂肪中的最高残留限量(MRL)为100 μg/kg；非班太尔、芬苯哒唑、奥芬哒唑的残留标志物在牛、羊、猪、马脂肪中的MRL为100 μg/kg，家禽中为50 μg/kg(仅芬苯哒唑)；奥苯哒唑的残留标志物在猪脂肪中MRL为500 μg/kg；噻苯哒唑的残留标志物在牛、猪、羊脂肪中的MRL为100 μg/kg；三氯苯哒唑的残留标志物在牛、羊脂肪中的MRL为100 μg/kg。但相关国家标准[7-8]、行业标准[9]和文献报道[2,10-16]中，主要是针对肌肉、肝、肾等动物组织或禽肉、蛋和奶中的苯并咪唑类药物及代谢物检测，极少涉及脂肪基质。由于脂肪的油脂含量大，包裹性和黏附性强[17]，导致提取非常困难，净化效果不佳。此外，脂肪含有较多饱和脂肪酸，氧化能力较强，而苯并咪唑类药物不稳定，前处理过程易发生降解，尤其是5-羟基噻苯达唑；若采用国标的净化流程，三氯苯达唑酮等残留标志物几乎不保留，加标回收率极低。本文采用更具广泛适用性的前处理方式，尤其是对易降解残留化合物的保护技术，并以极性大、穿透力强的乙腈作为提取溶剂，可有效减少脂溶性杂质的共提取[18]，从而建立了同时测定鸡、猪脂肪中上述11种苯并咪唑类药物残留标志物的高效液相色谱(HPLC)法，填补了脂肪中同时检测苯并咪唑类药物残留标志物的技术空白。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

LC-20AD高效液相色谱仪，配自动进样器、柱温箱、紫外检测器(岛津公司)；感量0.000 01 g的分析天平和感量0.01 g的天平(Sartorius公司)；GM 200型肉类组织捣碎机(Retsch公司)；MS 3 basic旋涡振荡器、减压旋转蒸发仪(IKA公司)；SW 30H超声波水浴(Sono Swiss公司)；3-30K离心机(Sigma公司)。

奥芬达唑、芬苯达唑、奥芬达唑-2-氨基砜、阿苯达唑-2-氨基砜、噻苯达唑、5-羟基噻苯达唑、2-氨基-5-苯甲酰基苯并咪唑、5-羟基甲苯达唑、氟苯达唑、奥苯达唑和三氯苯达唑酮，纯度均在97%以上(德国Dr.Ehrenstorfer公司)，各标准品先用10 mL N,N-二甲基甲酰胺溶解，再用甲醇配成200 mg/L标准储备溶液，使用时根据需要稀释成混合标准工作溶液。没食子酸丙酯(PG)；乙腈、甲醇(HPLC级，Fisher公司)，乙酸(色谱纯，Merck公司)；其它未特殊说明的试剂均为分析纯；Oasis MCX固相萃取柱(60 mg/3 mL，Waters公司)。猪脂肪和鸡脂肪均为送检样品。

1.2 实验方法

提取：称取2 g试样(准确至0.01 g)于50 mL离心管中，加入5 mL正己烷，涡旋振荡5 min，充分溶解脂肪，加入 10 mL 0.1 mol/L盐酸-乙腈(1∶1，体积比)和0.1 mL 20%PG甲醇溶液，涡旋2 min，置超声波水浴中超声5 min，涡旋振荡15 min，4 000 r/min 离心 5 min，取下层清液5 mL于15 mL离心管中，待净化。

净化：向待净化液中加入2.5 mL 0.1 mol/L盐酸，混匀后加入3 mL 正己烷，涡旋振荡2 min，10 000 r/min离心5 min，弃去上层正己烷，下层清液加入20%PG甲醇溶液0.1 mL，混匀，转入经预处理的MCX固相萃取柱中，以小于1 mL/min的流速使样品溶液全部过柱，弃去流出液。依次用3 mL 0.1 mol/L盐酸-甲醇(2∶1，体积比)、4 mL 5%氨水溶液淋洗，淋洗液全部过柱，弃去淋洗液，最后用4 mL 5%氨水甲醇洗脱。

浓缩：洗脱液以0.5 mL/min流速全部通过小柱，并收集于带刻度的浓缩瓶中，38 ℃水浴下减压旋转蒸发至约500 μL后，以0.1 mol/L盐酸定容至1 mL，涡旋2 min，溶液以10 000 r/min 离心5 min后，供测定。

1.3 液相色谱分析条件

Atlantis T3 色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱温：40 ℃；检测波长：292 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：40 μL；流动相：A为甲醇，B为1%乙酸；梯度洗脱程序:0～10.0 min，10%～45%A；10.0～15.0 min，45%～40%A；15.0～25.0 min，40%～75%A；25.0～35.0 min，75%～90%A；35.0～35.1 min，90%～100%A；35.1～45.0 min，100%A；45.0～45.1 min，100%～10%A；45.1～60.0 min，10%A。

2 结果与讨论

2.1 抗氧化剂的优化

2.1.1 抗氧化剂种类的选择脂肪中富含氧化能力强的饱和脂肪酸，对待测化合物尤其是5-羟基噻苯达唑有明显的降解破坏作用，前处理过程若不加抗氧化剂，将导致其回收率极低甚至色谱峰完全消失。林海丹等[11]的研究显示，1 g/100 mL二丁基羟基甲苯(BHT)可明显提高奥芬达唑、奥芬达唑砜等的提取效率。本实验比较了GB/T 21324-2007[7]中采用的BHT以及丁基羟基茴香醚(BHA)、特丁基对苯二酚(TBHQ)和PG的抗氧化效果。结果表明，BHA和TBHQ的抗氧化效果不佳，且待测化合物的色谱图中杂峰较多；BHT的抗氧化效果差，且由于其水溶性较差，在洗脱液旋蒸时易析出，导致液相色谱系统堵塞，此外BHT对三氯苯达唑酮有轻微降解作用，使其回收率在70%以下。而PG的抗氧化效果良好，干扰物与待测化合物的色谱峰可基本分离，且PG的水溶性较好，上机溶液澄清，对三氯苯达唑酮也有保护作用，可将其回收率提高15%～20%。本方法最终选择PG作为抗氧化剂。

2.1.2 抗氧化剂浓度的选择本实验采用甲醇溶解PG，比较了PG含量为5%、10%和20%时的抗氧化效果。结果显示，5%PG甲醇溶液对鸡、猪脂肪中5-羟基噻苯达唑的保护力度不够，其回收率不足50%。对于鸡脂肪，10%PG甲醇溶液即能很好地保护5-羟基噻苯达唑；但对于猪脂肪，则需20%PG甲醇溶液才能保护5-羟基噻苯达唑。本方法最终选择20%PG甲醇溶液作为抗氧化剂。

2.1.3 抗氧化剂加入次数的选择对于猪脂肪，若仅在提取或过柱前加1次20%PG甲醇溶液，5-羟基噻苯达唑的回收率低于80%，而在提取和过柱前加入2次抗氧化剂才能确保5-羟基噻苯达唑不被氧化。本方法最终选择分2次加入20%PG甲醇溶液。

2.2 净化方式的优化

采用MCX固相萃取柱进行净化，按照GB/T 21324-2007[7]的过柱条件处理加标样品时，发现0.1 mol/L盐酸淋洗液的除杂效果不佳，且三氯苯达唑酮会被洗脱下来，导致其回收率为零；以10%氨水乙腈为洗脱液时，则后续浓缩时间过长，且会影响2-氨基-5-苯甲酰基苯并咪唑的回收率。本方法改用0.1 mol/L盐酸-甲醇(2∶1)为淋洗液，可除去大部分杂质且三氯苯达唑酮不会被洗脱下来,再配合使用5%氨水溶液淋洗，能有效去除奥芬达唑-2-氨基砜和5-羟基噻苯达唑两峰之间的杂质；以5%氨水甲醇为洗脱液对各组分的洗脱比较稳定，方法重现性较好，后续浓缩方便快捷。

2.3 方法学验证

2.3.1 线性关系与定量下限在鸡脂肪和猪脂肪空白样品中，分别添加10.0 mg/L的待测物标准工作溶液，按照本方法进行测定，以信噪比(S/N)≥10,且回收率和相对标准偏差(RSD)均符合残留检测方法要求时的浓度为定量下限(LOQ)。采用本方法对质量浓度为25.0、50.0、100、200、500、1 000 μg/L的系列标准工作溶液进行测定，以待测物的峰面积(Y)对其质量浓度(X)进行线性回归，绘制标准工作曲线。结果表明，11种待测物均在25.0～1 000 μg/L范围内线性关系良好，相关系数(r)均大于0.999 8，LOQ均为50 μg/kg，能够满足相关监管部门的要求。

2.3.2 准确度与精密度准确称取2.0 g空白鸡脂肪和猪脂肪试样于50 mL离心管中，加入标准工作溶液，制成3个浓度水平的加标样品，每个浓度做6个平行，按本方法处理后进行测定。结果表明，11种待测物的加标回收率为82.0%～109%，RSD为0.71%～9.9%(见表1)。

表1 脂肪样品中11种目标分析物的加标回收率及相对标准偏差(n=6)Table 1 Recoveries and relative standard deviations of 11 analytes in fat samples(n=6)

图1 猪脂肪空白加标样品的色谱图(100 μg/L)Fig.1 Chromatogram of spiked pig fat sample(100 μg/L)1.albendazole-2-aminosulfone;2.5-hydroxythiabendazole;3.thiabendazole;4.mebendazole-amine;5.5-hydroxy-mebendazole;6.oxibendazole;7.oxfendazole;8.oxfendazole sulphone;9.flubendazole;10.fenbendazole;11.ketotriclabendazole

2.4 实际样品测定

采用本方法检测了广州市售的鸡脂肪和猪脂肪样品各30份，均未检出以上11种苯并咪唑类药物残留标志物，猪脂肪空白加标样品的色谱图见图1。本实验室对猪、鸡的肌肉、肝脏、肾脏的日常检测显示，11种苯并咪唑类药物残留标志物的检出率极低，说明养殖行业对该类药物的使用较为规范。

3 结 论

本文对抗氧化剂和净化方式进行了优化，建立了同时测定鸡脂肪和猪脂肪中11种苯并咪唑类药物残留标志物的高效液相色谱法。虽然本方法的灵敏度与选择性会明显低于液相色谱-串联质谱法，但液相色谱仪在基层实验室较为普及，因此适用性更广泛。本方法的定量下限为50 μg/kg，回收率为82.0%～109%，相对标准偏差为0.71%～9.9%，方法定量准确、抗干扰能力强、重现性好，能够满足我国相关监管部门的最新技术要求。