中药石香膏对糖尿病大鼠慢性难愈合创面RAGE/NF-κBp65/eNOS mRNA表达影响的研究❋

凌一鸣，费 冀，张开伟，周一夫，沈冯君

(1. 贵州中医药大学，贵阳 550002； 2. 贵州省中医医院骨伤科，贵阳 550001)

慢性难愈合创面是指各种因素导致伤口不能正常愈合，且皮肤解剖和功能的完整性不能在大约1个月内实现的疾病。主要病因包括糖尿病溃疡、褥疮、小腿静脉溃疡和手术部位感染等[1-3]。该病发病率高、病程长、治愈率低，给患者及社会带来了沉重负担。据统计，该类患者占总住院患者比例的1.7‰，平均住院花费1.2万元，但仅有一半患者可以痊愈[4]。 在全国名老中医沈冯君教授的经验基础上，贵州省中医医院院内制剂“石香膏”经过大量的临床研究证实，对于慢性难愈合创面修复具有显著疗效[5-7]。先前有关基础研究已证实，中药石香膏能够通过刺激创面内细胞产生内源性生长因子，激发成纤维细胞增殖，进而促进创面的修复[8]。本研究通过建立糖尿病溃疡大鼠模型，从RAGE/NF-κBp65/eNOS mRNA表达水平的变化观察石香膏外用对于创面愈合的干预作用，更深层次探究其作用机制，为该药的进一步研究及临床应用提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 受试药物 石香膏制备过程：将乳香 150 g、没药 150 g、赤石脂 150 g、栀子150 g、煅龙骨 150 g、冰片150 g一同打成细粉末状以方便制备。将约2 L麻油倒入锅中加热，充分加热至冒烟后，缓慢加入炉甘石500 g并充分搅拌，防止锅内液体起泡溢出。待炉甘石搅拌均匀后，分别倒入已经磨好的乳香粉、没药粉、赤石脂粉、栀子粉、煅龙骨粉、冰片粉，持续充分搅匀，约1 h熬成面糊状约即可，此时加入约200 g蜂蜡，待冷却后石香膏即制备完成。此操作于贵州省中医医院中药制剂室制备。贝复济(重组牛碱性成纤维细胞生长因子溶液)购自珠海亿胜生物制药有限公司。

1.1.2 实验动物 50只清洁级雄性SD大鼠，体质量300～350 g，由贵州医科大学实验动物中心(贵州省实验动物工程技术中心)提供(生产许可证号SCXK(黔)2012-0001)，于贵州医科大学实验动物中心实验室分笼饲养。

1.1.3 主要试剂、仪器 免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法(streptavidin-biotinperoxidase method，SP)试剂盒；核因子-κB P65(Nuclear Factor-κ-gene Binding P65，NF-κB P65)一抗(#8242，1∶1000 稀释)，核因子-κB pP65(Nuclear Factor-κ-gene Binding P65，NF-κB P65)一抗(#3039，1∶1000 稀释)，内皮型一氧化氮合酶 (endothelial nitric oxide synthase，eNOS)一抗(#9572，1∶1000稀释)购自武汉博士德公司；荧光定量PCR试剂(qPCR)，sybr green I，RT试剂，以上试剂均购自Western Biotechnology公司；DEPC处理水(DNase/RNase-free)购自美国Sigma公司；RNA提取剂(TRIzol)购自中国碧云天公司；实时荧光定量 PCR 仪购自加拿大Funglyn Biotech公司；电泳仪购自美国Bio-rad公司；凝胶成像仪购自美国Tianneng公司；GDS8000 凝胶扫描系统购自美国UVP公司。

1.2 动物分组及造模

1.2.1 实验动物分组 50只清洁级雄性SD大鼠分笼饲养，维持饲养环境稳定，湿度50% 左右，温度25 ℃左右，明暗周期12 h，自由饮水和进食，适应性喂养3周后称重记录。按随机数字表法分为正常对照组(正常组)、正常创面对照组(正常对照组)、慢性难愈合创面组(难愈合组)、贝复济处理慢性难愈合创面组(贝复济组)、石香膏处理慢性难愈合创面组(石香膏组)5组，共设2时间点(分别为造模后7 d/14 d),每组每时间点5只共50只。

1.2.2 建立诱导糖尿病大鼠模型 造模前禁食18 h，可自由饮水；造模前先测量大鼠体质量并记录，比较大鼠前后体质量差异变化。用采血针于尾静脉处采血，血糖仪测定血糖，分别记录各大鼠血糖值；然后以pH值为4.0，浓度为 0.1 mmol/L柠檬酸钠缓冲液溶解链脲佐菌素(STZ)配制成1%溶液，将配置好的溶液以65 mg/kg的标准一次性腹腔注射于难愈合组、贝复济组、石香膏组大鼠体内，72 h后用上述测血糖方法测量，若随机血糖值>16.7 mmol/L，即为诱导糖尿病模型。若测得随机血糖>33.3 mmol/L，按血糖升高程度，肌肉注射诺和灵R(1-4 U/d)控制血糖，以提高实验数据准确性，减少误差。正常对照组组大鼠仅注射浓度为0.1 mmol/L柠檬酸钠缓冲液作为对照[9]。

1.2.3 建立慢性难愈合创面大鼠模型 注射1周后剃去正常对照组、难愈合组、贝复济组、石香膏组大鼠背部毛发，给予硫化钡再次脱毛，用盐酸氯胺酮(100 mg/kg)腹腔注射进行麻醉，将腰椎正中偏上处定为造模区并标记一直径约3 cm的圆形区域，术前备皮，在标准无菌操作下沿圆形区域剪去皮肤、皮下组织直至显露肌筋膜，形成大鼠全层皮肤缺损开放性创面。

1.3 动物用药

待大鼠创面充分止血后用药，给药剂量按《中药药理研究方法学》所提供的《实验动物与人按体表面积比等效剂量换算比率表》倍数折算，计算出人鼠等效剂量为11.61 g/kg。贝复济组创面外用贝复济约0.2 ml，石香膏组创面外敷石香膏厚度约2 mm，保证完全覆盖创面，正常对照组、难愈合组、贝复济组、石香膏组均以两层无污染清洁纱布敷料覆盖，胶布充分固定牢靠。从术前1 d起开始计算，连续4 d对各大鼠肌注青霉素(4000 U/只)防止感染。饲养方法同前。

1.4 标本采集

分别在创面造模后第7天、第14天给予盐酸氯胺酮(100 mg/kg)腹腔注射进行麻醉，取正常对照组、难愈合组、贝复济组、石香膏组大鼠背部创面肉芽组织标本。部分肉芽组织标本采用10%甲醛溶液固定，制成石蜡块保存；部分置于-70 ℃冰箱中保存。

1.5 检测

用切片机将石蜡块中的组织切成5 μm厚的薄片，经烤片、脱蜡、复水后HE染色，光镜下观察大鼠背部创面生长情况和病理变化。

使用Trizol法提取大鼠背部创面肉芽组织标本中的RNA，用随机引物将RNA进行逆转录反应，总反应体系20 μL，25℃10 min，42℃50 min，85℃5 min合成cDNA，然后设计特异性的引物和sybr green Ⅰ荧光染料进行荧光定量PCR检测，总反应体积50 μL，条件设置94℃4 min，94℃20sec，60℃30sec，72℃30sec循环35次，72 ℃时检测信号。RAGE：上游：5′-GGGACTCTTCACGCTTCGG-3′，下游：5′-ACCTTCAGGCTCAACCAACAG-3′，目的片段长度：187 bp；NF-κBp65：上游：5′-,下游：5′-GGGTGCGTCTTAGTGGTATCTG-3′,目的片段长度：168 bp；eNOS：上游：5′-GCAACAAACCGAGGCAATC-3′，下游：5′-GGTCCAGCCATGTTGAATACAG-3′，目的片段长度：189 bp。β-actin作为内参，2-△CT法计算相对表达量。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 创面大体形态观察

图1显示，正常对照组(B1、B2)与难愈合组(C1、C2)在造模14 d后创面仍未完全修复，而贝复济组(D1、D2)与石香膏组(E1、E2)在造模14 d后创面修复情况较好，且石香膏组比贝复济组愈合情况更好。

注：B1.造模后7 d正常对照组；B2.造模后14 d正常对照组；C1.造模后7 d难愈合组；C2.造模后14 d难愈合组；D1.造模后7 d贝复济组；D2.造模后14 d贝复济组；E1.造模后7 d石香膏组；E2.造模后14 d石香膏组图1 干预7/14 d后正常对照组、难愈合组、贝复济组、石香膏组大鼠创面大体形态观察比较

注：B1.造模后7 d正常对照组；B2.造模后14 d正常对照组；C1.造模后7 d难愈合组；C2.造模后14 d难愈合组；D1.造模后7 d贝复济组；D2.造模后14 d贝复济组；E1.造模后7 d石香膏组；E2.造模后14 d石香膏组图2 干预7/14 d后正常对照组、难愈合组、贝复济组、石香膏组大鼠创面组织HE染色光镜比较(HE×400)

2.2 创面组织镜下观察

图2显示，正常对照组(B1、B2)与难愈合组(C1、C2)在造模14 d后镜下仍可见大片未修复组织，而贝复济组(D1、D2)与石香膏组(E1、E2)在造模14 d后创面组织修复情况较好，镜下可见较多的纤维细胞和成纤维细胞，促进新生血管形成及创面修复，两者比较石香膏组修复情况较好。

2.3 RAGE mRNA、NF-κBp65 mRNA和eNOS mRNA表达情况

表1显示，干预7 d后与正常对照组比较，难愈合组中RAGE mRNA、NF-κBp65 mRNA相对表达量升高，eNOS mRNA相对表达量降低，石香膏组和贝复济组中RAGE mRNA、NF-κBp65 mRNA相对表达量降低，eNOS mRNA相对表达量升高，差异有统计学意义(P<0.01)。与难愈合组比较，贝复济组和石香膏组中RAGE mRNA、NF-κBp65 mRNA相对表达量降低，eNOS mRNA相对表达量升高，差异有统计学意义(P<0.01)。与贝复济组比较，石香膏组中RAGE mRNA、NF-κBp65 mRNA相对表达量降低，eNOS mRNA相对表达量升高，差异有统计学意义(P<0.01)。

表1 干预7 d后各组RAGE mRNA、NF-κBp65 mRNA和eNOS mRNA相对表达量比较

注：与同时间点正常对照组比较：(1)P<0.01；与同时间点难愈合组比较：(2)P<0.01；与同时间点贝复济组比较：(3)P<0.01

表1显示，干预14 d后与正常对照组比较，难愈合组中RAGE mRNA、NF-κBp65 mRNA相对表达量升高，eNOS mRNA相对表达量降低，差异有统计学意义(P<0.01)。石香膏组RAGE mRNA、NF-κBp65 mRNA相对表达量降低，eNOS mRNA相对表达量升高，差异有统计学意义(P<0.01)。与难愈合组比较，贝复济组和石香膏组中RAGE mRNA、NF-κBp65 mRNA相对表达量降低，eNOS mRNA相对表达量升高，差异有统计学意义(P<0.01)。与贝复济组比较，石香膏组RAGE mRNA、NF-κBp65 mRNA相对表达量降低，差异有统计学意义(P<0.01)。

3 讨论

慢性难愈合溃疡创面的中医辨证属于“痈疽”范畴。“痈疽”的中医病机为各种原因导致局部气血壅遏，脉络不畅，终致肉腐血败。《素问·生气通天论》所云:“营气不从，逆于肉理，乃生痈肿。”经过长期的实践与探索，形成了“提脓祛腐，煨脓长肉”的创新性理论体系。前者依据“腐不去则新肉不生”的理论，使用丹类药物，使疮疡内腐肉脱落，脓毒排出；后者则是指在疮疡祛腐排脓之后，运用敛疮生肌、活血化瘀类药物调节患处气血，促进局部组织快速生长。中药“石香膏”是由乳香、没药、赤石脂、栀子、煅龙骨、冰片、炉甘石等药物调制而成。方中乳香、没药均能活血定痛，消肿生肌；赤石脂止血生肌，收湿敛疮；栀子清热利湿，凉血解毒；煅龙骨收敛固涩；冰片清热解毒，去腐生肌；炉甘石收湿止痒敛疮解毒。膏中溶剂为麻油和蜂蜡，不仅能保持创面的湿润，还能避免药物对皮肤的过度刺激，以充分促进创面肉芽的生长及上皮组织的再生。现代药理学认为，乳香能通过抑制促炎症反应细胞活素类的生成，减少基质金属蛋白酶的分泌与活性进行抗炎、抗菌以及抗溃疡[10]；没药、赤石脂能缩短凝血酶时间，抑制血小板聚集，使伤口具有良好的祛瘀、止血效果[11-12]；栀子具有抗氧化、抗细胞凋亡和促血管内皮细胞生长的功能[13]；煅龙骨中的锌参与核酸及蛋白质代谢，维持细胞膜的正常生理功能和调节机体免疫功能，积极参与损伤的修复过程，有助于慢性难愈合伤口的愈合[14]；冰片具有消炎、镇痛、抗菌的作用，特别是对金黄色葡萄球菌有较好的抑制作用[15]；炉甘石能促进成纤维细胞的增殖和迁移，加快毛细血管生长，促进血液循环，最终加快伤口愈合[16]。将这些药物联合使用，起到“提脓祛腐，煨脓长肉”的治疗效果。贝复济作为本次试验的对照药物，具有改善局部血液循环，促进创面修复的作用。

创面修复是一个包括凝血过程、组织增殖等多个阶段的复杂过程。由于致伤因子的作用造成局部组织破坏缺损，局部组织通过再生、修复、重建等一系列过程对患处进行修补[17]。糖尿病患者因为长期处于高血糖状态下，易生成AGEs(Advanced glycation end products，糖基化终末产物)，此物质为体内蛋白在非酶糖化和氧化反应下与还原糖结合形成的结构，对创面愈合有抑制作用[18]。由于AGEs在各种细胞中的积累，细胞结构和功能可能会随着RAGE的参与而变化。RAGE是AGEs的受体，是细胞表面分子免疫球蛋白家族的成员，由多种细胞表达，可能介导炎症体的激活和随后炎症介质的释放，从而促进天然免疫反应的传播[19-20]。当AGEs和RAGE结合后，触发不同的信号传导。NF-κB即为其产物之一，NF-κB是具有转录激活调节功能的一种转录因子，由p50和p65等亚基组成，其中p65亚基是NF-κB中分布最广、作用最强的成员[21]。NF-κB的激活会促进多种基因的表达，调节免疫反应和炎症反应，破坏组织修复细胞[22]。p65亚基的增加会促进RAGE抑制抗炎因子的同时增加促炎因子的活性，抑制组织修复。NF-κBp65的活化靶向激活许多基因表达，如TF、p21 RAS、细胞外信号调节激酶1/2(ERK 1/2)以及RAGE本身的表达。这些促氧化基因的激活可以促进NOS(Nitric oxidesynthase，一氧化氮合酶)在其他辅助因子的作用下，使NO(一氧化氮)分泌增加,可以促进血管修复再生，在调节血管稳态方面有重要作用。eNOS是NOS其中的一个同工酶，产生的NO可以调节如蛋白质的转运、氧化还原等过程。皮肤创面组织主要表达的是eNOS，并由eNOS维持皮肤组织中NO代谢的平衡[23-24]。

本次研究通过建立实验性慢性难愈合创面大鼠模型，观察了中药“石香膏”外敷对其创面RAGE、NF-κBp65、eNOS信号通路mRNA的表达情况。研究表明，与慢性难愈合创面组比较，石香膏处理慢性难愈合创面组与贝复济处理慢性难愈合创面组RAGE mRNA、NF-κBp65 mRNA相对表达量降低，eNOS mRNA相对表达量升高。其中RAGE mRNA、NF-κBp65 mRNA降低程度在7 d、14 d时石香膏处理慢性难愈合创面组均优于贝复济处理慢性难愈合创面组。而对于eNOS mRNA，在7 d时石香膏处理慢性难愈合创面组其表达量优于贝复济组，在14 d时两者未见明显差异。综上所述，石香膏对于难愈性创面的修复效果优于贝复济。本次动物实验研究初步阐明了中药石香膏对于慢性难愈合创面具有修复作用，推测其作用机制之一为抑制RAGE mRNA、NF-κBp65 mRNA表达，减少细胞组织损害，从而促进eNOS mRNA的表达，增加NO分泌，有助于创面的血管新生和伤口愈合，为临床中医治疗慢性难愈合创面开拓了新的思路与方法。