三疣梭子蟹PtCrustin2抗菌肽基因优化及其在毕赤酵母中高效表达

王艳慧， 陶 妍

(上海海洋大学 食品学院 上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心， 上海 201306)

目前，抗生素在生物机体内的残留问题及微生物耐药性问题已经成为医学和环境科学界面临的重大挑战，因此，研究和开发能够替代传统抗生素的天然生物类抗菌剂势在必行，由此开展的抗菌肽方面的研究也应运而生。抗菌肽广泛存在于生物体内，是一类具有广谱抗菌活性的小分子多肽[1-2]。研究表明，水生动物由于其栖息环境不同于陆生动物而致使其体内拥有更为丰富的抗菌肽；尤其是水生动物中的甲壳类动物，虽然其体内缺乏具有“记忆效应”的特异性免疫机制，但仍然能抵御各种病原微生物的侵染，由此可以推断它们主要是依赖自身先天性非特异性免疫系统中存在的诸多免疫因子[3]，而抗菌肽则是防御细菌、真菌和病毒等病原微生物入侵的最重要分子屏障[4-6]。

Crustin是甲壳类动物来源的一系列富含半胱氨酸的小分子抗菌肽；除去N端信号肽序列后的肽段被称为成熟肽，8个高度保守的半胱氨酸残基位于成熟肽区域中，可形成由4个二硫键联接的WAP结构域；成熟肽赋予了crustin的生物学功能[7]。最初从普通滨蟹(Carcinusmaenas)的血淋巴中分离到的I型crustin具有抑制部分革兰氏阳性菌的活性[8]；之后发现在三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)的血细胞和眼柄中存在3种I型crustin的同工型基因(PtCrustin1、PtCrustin2、PtCrustin3)，通过大肠杆菌原核表达系统对其中的PtCrustin2基因进行重组表达后，发现重组体PtCrustin2具有抑制金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的生物学活性[9]。众所周知，大肠杆菌表达系统没有真核翻译后加工的功能，难以形成正确的二硫键配对和空间构像折叠，因而产生的蛋白质经常是不溶的，会在细菌内聚集成包涵体而没有足够的生物学活性[10-11]。有鉴于此，近几年来我们开展了基于毕赤酵母真核表达系统的各种水产生物来源抗菌肽的重组DNA表达[12-15]；就三疣梭子蟹PtCrustin2的真核表达而言，在先前的研究中，通过RT-PCR获得编码其成熟肽的天然cDNA，以pPIC9K为表达载体、毕赤酵母GS115为工程菌，初步实现了PtCrustin2的重组DNA 表达[16]。然而，因使用的表达载体为pPIC9K，目的片段5′端所添加的限制性内切酶位点为EcoR I，导致表达的重组体PtCrustin2 带有非天然的N末端；另一方面，由于使用的编码PtCrustin2成熟肽的基因为天然cDNA，对于毕赤酵母来说可能存在某些密码子的限制，所以导致了较低的表达量。

本研究在前期研究的基础上，根据毕赤酵母的密码子偏爱性对编码三疣梭子蟹PtCrustin2成熟肽的天然cDNA进行密码子优化并合成，选择pPICZαA替代pPIC9K作为表达载体、毕赤酵母X-33为工程菌，以期提高重组体目的蛋白的表达量，为进一步扩大制备重组体PtCrustin2及深入研究其抑菌机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 载体、菌种和试剂

表达载体pPICZαA、毕赤酵母X-33和博来霉素由Invitrogen公司(美国)提供；克隆载体pMD-19T simple、限制性内切酶(XhoⅠ、XbaⅠ、SacⅠ)和T4 DNA连接酶由Takara公司(日本)提供；大肠杆菌DH5α来源于本实验室；PCR反应试剂、DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒、DNA分子量Marker、蛋白质分子量Marker和酵母基因组提取试剂盒均由天根生化科技有限公司(北京)提供；抗His标签鼠单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG (H+L)由北京康为世纪生物科技公司提供；低盐LB培养基、YPDS平板、MD平板、MM平板、BMG和BMM培养基均按照Invitrogen公司的说明书配制。

1.2 smPtCrustin2基因的优化合成

根据已经登录(GenBank：JQ728435)的三疣梭子蟹PtCrustin2的cDNA序列，参考酵母的密码子偏爱性，使用JAVA Codon Adaption Tool(http://www.jcat.de/Start.jsp)，对编码PtCrustin2成熟肽的相关密码子进行优化，由上海生工生物工程有限公司合成目的基因smPtCrustin2，在该目的基因的5′端依次添加Kex2信号肽酶切位点和XhoI酶切位点，在其3′端依次添加6×his标签和XbaI酶切位点。DNA测序委托上海生工生物工程有限公司完成。

1.3 构建pPICZαA-smPtCrustin2及其鉴定

合成的目的基因以重组质粒(pUCk-smPtCrustin2)的形式存在于大肠杆菌DH5α中；质粒经纯化后，对pUCk-smPtCrustin2进行XhoI和XbaI的双酶切；目的片段经回收后与pPICZαA(经同样酶切割过)混合(1∶ 4，V/V)，于16 ℃经T4DNA连接酶作用16 h；转化大肠杆菌DH5α后在低盐LB培养基中37 ℃培养12 h。通过XhoI和XbaI双酶切验证、菌落PCR和DNA测序验证重组表达载体pPICZαA-smPtCrustin。

1.4 转化毕赤酵母X-33及阳性酵母转化子的筛选

经SacI线性化处理后的pPICZαA-smPtCrustin2与毕赤酵母X-33感受态细胞混合(1∶ 8，V/V)，在0.2 cm电转杯中的电转条件如下：25 μF、200 Ω、1.5 kV；加入1 mL山梨醇(1 mol/L)；于30 ℃放置2 h后离心，菌体涂于含100 μg/mL博来霉素的YPDS平板上，在30 ℃避光培养至单克隆产生；挑取单菌落分别转接至MM及MD平板上，筛选高拷贝甲醇利用快速型酵母转化子；同时将线性pPICZαA空载体电转入毕赤酵母X-33中作为阴性对照。以筛选到的转化子的基因组DNA为模板，用pPICZαA载体上的醇氧化酶基因的引物5′AOX1和3′AOX1进行PCR以鉴定阳性转化子。

1.5 在毕赤酵母X-33中诱导表达目的蛋白及其表达产物的纯化

将含pPICZαA-smPtCrustin2的阳性酵母转化子于BMG培养基中培养至OD600为4～5(30 ℃、250 r/min)；对其进行离心后，收集的菌体接种于BMM培养基，在28 ℃、250 r/min条件下使用0.5%甲醇诱导培养96 h，保持甲醇体积为0.5%；培养液经离心后，使用0.22 μm滤膜对上清进行过滤，通过固化金属离子亲和层析(IMAC)分离纯化重组蛋白，经福林-酚法测定纯化产物的浓度，并估算表达量。Tricine-SDS-PAGE条件：4%浓缩胶、10%夹层胶、15.5%分离胶。

1.6 重组体smPtCrustin2的Western Blot分析

经Tricine-SDS-PAGE后的凝胶上的条带在100 V电压下，经过1.5 h电转至PVDF膜上，用TBST洗膜3次(每次10 min)，将膜浸于封闭液中1 h；再用TBST洗膜3次(每次10 min)，先与鼠单克隆抗体室温下培育2 h，用TBST洗去剩余抗体；再与辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG (H+L) 室温下培育1 h，用TBST漂洗后使用DAB试剂盒进行显色。

2 结果与分析

2.1 优化前后的PtCrustin2成熟肽基因比较

如图1所示，优化后的smPtCrustin2分子量为270 bp，除去XbaI、XhoI、终止密码子、6×his标签和Kex2酶切位点，编码了由77个氨基酸残基组成的PtCrustin2成熟肽；在不改变氨基酸残基的前提下，半胱氨酸、脯氨酸、谷氨酸、赖氨酸、天冬氨酸等15个残基的密码子被修改。与天然cDNA“mPtCrustin2”相比，其5′端添加的XhoI酶切位点和Kex2信号肽酶切位点预示了表达的重组体smPtCrustin2含天然N末端。

2.2 基于菌落PCR和双酶切的重组表达载体pPICZαA-smPtCrustin2的鉴定

构建的重组表达载体pPICZαA-smPtCrustin2如图2所示。首先，采用pPICZαA的通用引物5′AOX1和3′AOX1对含pPICZαA-smPtCrustin2的大肠杆菌进行菌落PCR鉴定，结果如图3-a所示，1个约743 bp的理论分子量条带非常明显。另外，采用XhoI和XbaI对纯化的pPICZαA-smPtCrustin2进行双酶切鉴定，电泳结果显示了1个与smPtCrustin2的理论分子量(270 bp)相符的条带，而另一个在近10 000 bp处的条带属于pPICZαA(图3-b)。此外，对pPICZαA-smPtCrustin2的DNA测序结果也证明了pPICZαA与smPtCrustin2连接正确。

*为终止密码子；下划线为Kex2信号肽酶切位点；斜体为限制性酶切位点；方框为6×his标签；阴影为半胱氨酸残基

图1密码子优化前后的PtCrustin2成熟肽基因的比较

Figure 1 Comparison of mPtCrustin2 optimized and un-optimized for codons

图2 pPICZαA-smPtCrustin2重组表达载体的构建

M：DNA 分子量Marker；1：PCR扩增产物；2：酶切产物

图3基于菌落PCR(a)和双酶切(b)的pPICZαA-smPtCrustin2鉴定

Figure 3 Identification of pPICZαA-smPtCrustin2 by colony PCR (a) and endonuclease digestion (b)

2.3 酵母转化子的鉴定

通过含100 μg/mL博来霉素的YPDS平板筛选和MM及MD平板筛选，共获得6株高拷贝酵母转化子；经培养并提取基因组DNA为模板，以上述的5′ AOX1和3′-AOX1为引物进行PCR验证，同时以含pPICZαA空载体的酵母转化子作为阴性对照。PCR结果如图4所示，1～6号泳道均显示了与理论分子量相符的约743 bp的条带；另一个由7号泳道显示的约493 bp的条带符合阴性对照的理论分子量，据此，可以证明pPICZαA-smPtCrustin2与毕赤酵母基因组DNA已成功整合。

M：DNA 分子量Marker；1～6：含有pPICZαA-smPtCrustin2的转化子；7：含有pPICZαA的转化子

图4基于PCR的阳性酵母转化子的鉴定

Figure 4 Identification of positive yeast transformants by PCR

2.4 基于甲醇诱导表达的重组体smPtCrustin2及其纯化

在BMM培养基中于28 ℃、250 r/min条件下，对筛选到的高拷贝甲醇利用快速型酵母转化子进行96 h的0.5%甲醇诱导培养；对培养液进行IMAC法纯化后，经Tricine-SDS-PAGE分析显示(图5)：共有2条清晰明显的条带(1号泳道)，小于14.4 ku的条带应该为目的条带，而在近20 ku处的条带被推测是目的蛋白形成的二聚体。另一方面，含空载体的酵母转化子的表达上清中并未出现任何明显条带(2号泳道)，由此证明重组体smPtCrustin2被成功表达。通过福林-酚法测定的纯化产物浓度为0.56 mg/mL，进一步推算至产量为22.4 mg/L。

2.5 基于Western Blot分析的重组体smPtCrustin2的鉴定

对上述纯化产物进行Western Blot分析，因重组体smPtCrustin2的C端含6×his标签，所以与鼠单克隆抗体(抗his标签)能够杂交。结果如图6所示，1号泳道为纯化产物，在约10 ku处的一个明显杂交条带应该属于目的蛋白；而大于16 ku的另一个杂交条带可能为目的蛋白的二聚体。2号泳道是含pPICZαA空载体的酵母转化子的表达上清，未见任何明显的杂交条带。Western Blot分析的结果基本上与Tricine-SDS-PAGE分析的结果相符，由此证明通过本研究建立的毕赤酵母表达系统可以成功表达重组体目的蛋白。

M：蛋白质分子量Marker；1：纯化的smPtCrustin2；2：含pPICZαA空载体的酵母培养液上清

图5纯化的smPtCrustin2的Tricine-SDS-PAGE分析

Figure 5 The purified smPtCrustin2 was analyzed by tricine-SDS-PAGE

M：蛋白质分子量Marker；1：纯化的smPtCrustin2；2：含pPICZαA空载体的酵母培养液上清

图6纯化的smPtCrustin2的WesternBlot分析

Figure 6 The purified smPtCrustin2 was analyzed by Western Blot

3 讨论

三疣梭子蟹属于无脊椎动物中的水产甲壳类动物，主要依靠血细胞吞噬和包囊化作用发挥其防御机能。它们虽然缺乏抗体介导的特异性免疫功能、不产生免疫球蛋白，但具有先天性的非特异性免疫系统，能够识别和有效清除入侵的病原微生物[17]。由此可以推测，较脊椎动物而言，由甲壳动物免疫系统产生的免疫因子具有更为天然的优势成为天然抗菌剂开发的良好候选者。我们在前期研究中，聚焦于三疣梭子蟹先天性免疫系统中的重要免疫因子PtCrustin2成熟肽，对其天然cDNA进行了克隆和实现了在毕赤酵母中的表达[16]，然而，如前言中述及的因前期研究策略上存在弊端，表达效率很低。据此，本文通过3个方面对毕赤酵母表达系统进行了改进。

根据Yang等[18]的报道，他们对黑曲霉(Aspergillusniger)lip2基因的密码子进行优化后在毕赤酵母细胞中的表达量和生物学活性分别提高了11.6和5.3倍；王方芹等[19]根据酿酒酵母的密码子偏爱性优化了黑曲霉的α-L-鼠李糖苷酶基因rha，发现重组rha的表达量提高了2.9倍；我们最近报道的在毕赤酵母X-33中高效表达的斑马鱼重组β-防御素(zfDB3)的编码基因中有28个密码子也是被优化过的[20]。此外，杨刚刚等[21]通过对载体-宿主菌组合的改变，显著提高了重组蛋白的表达量。有鉴于此，本文一方面参考毕赤酵母的密码子偏爱性，对编码三疣梭子蟹PtCrustin2成熟肽的天然cDNA进行检测，对显示低频的53个密码子进行了优化；另一方面，将之前使用的表达载体pPIC9K改为pPICZαA，因后者分子量较小，其长度仅为pPIC9K的1/3，使得转化操作和染色体的整合相对更容易；此外，将宿主由原来的毕赤酵母GS115改为毕赤酵母X-33，因X-33属野生型的酵母菌株，其对外源蛋白具有更强的分泌和适应能力[22]。本研究结果证明，上述的改进策略使重组体smPtCrustin2的表达量与之前未经密码子优化的表达量(5.25 mg/mL)[16]相比，提高了4倍以上，达到了本研究的预期目的。通过对目的基因5′端进行XhoⅠ酶切位点和Kex2信号肽酶切位点的添加，确保了“重组体smPtCrustin2”在分泌表达至胞外时含有纯粹的N末端。

4 结论

本研究通过使用经密码子优化的三疣梭子蟹PtCrustin2成熟肽基因“smPtCrustin2”和构建重组表达载体pPICZαA-smPtCrustin2，在毕赤酵母X-33中，经0.5%甲醇诱导，在28 ℃、250 r/min条件下培养96 h，获得含重组体smPtCrustin2的表达产物，经IMAC法得到纯化的重组体smPtCrustin2，表达量为22.4 mg/L。