响应面法优化重组大肠杆菌产谷氨酸脱氢酶培养基的研究

张雨晴， 尹新坚， 吴坚平, 杨立荣

(浙江大学 工业生物催化浙江省工程实验室， 杭州 310027)

谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase，GluDH, EC 1.4.1.2-1.4.1.4)是一类依赖烟酰胺类辅酶NAD(P)+/NAD(P)H的氧化还原酶[1-4]，能够可逆的将谷氨酸氧化脱氨生成α-酮戊二酸。该酶主要以四聚体和六聚体两种形式广泛存在于各种动植物、微生物体内[5-7]，在碳、氮代谢中起着至关重要的作用。GluDH在临床及农业、工业领域具有非常广泛的应用[8]，同时为酶学性质研究提供了丰富的素材[9-10]。在有机合成领域，GluDH 在天然及非天然氨基酸制备方面同样表现出巨大的应用潜力，GluDH催化合成氨基酸类化合物原理如图1所示。与化学法相比，利用GluDH等酶合成光学纯的天然及非天然氨基酸[11-13]，具有高效、环保、安全及立体选择性高等一系列优点，是符合绿色先进生产理念的先进制造技术。草铵膦(4-[羟基(甲基)膦酰基]-DL-高丙氨酸)是一种含磷的氨基酸类除草剂，具有农作物安全、活性高、杀草谱广、药害小等优点，是目前转基因抗性作物理想的除草剂，应用前景十分广阔[14-16]。前期工作中，本实验室已经开发出一株能够胺化还原2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基丁酸)(PPO)合成 L-草铵膦的重组谷氨酸脱氢酶。为推进该工艺的工业化应用，还需优化培养基来降低生物催化剂的制备成本。

重组大肠杆菌培养基优化方法主要包括单因素试验法[17]、正交设计试验法[18-19]、均匀设计法[20]以及响应面设计优化法[21-25]等。其中响应面设计优化法具有试验周期短，求得的回归方程精度高，能研究几种因素间交互作用等优点，是一种优化反应条件和工艺参数的有效方法[26]。本文首先采用单因素试验，确定发酵培养基中最适的碳、氮源，再利用Plackett Burman设计确定培养基中影响显著的因子。在此基础上利用最陡爬坡实验确定显著因子的适宜浓度范围，并根据Box-Bohnken的中心组合设计实验和响应面分析确定最优的发酵培养基配方，为工业化生产提供参考。

图1 谷氨酸脱氢酶合成氨基酸类化合物示意图

1 材料与方法

1.1 菌株和培养基

菌株：产GluDH重组菌由本实验室保藏，该GluDH基因来源于Pseudomonasputida，表达载体为pET-28a(+)，宿主为E.coliBL21(DE3)。

培养基：重组菌种子LB培养基(g/L)，酵母粉 5，胰蛋白胨 10，NaCl 10，调pH值至7.0;原始液体发酵培养基(g/L)：Na2HPO4·12H2O 17.1，KH2PO43.0，NaCl 0.5，NH4Cl 1.5，MgSO4·7H2O 0.1，甘油5，酵母粉10;各培养基根据需要添加终浓度为50 mg/L的卡那霉素。

1.2 试剂

2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(PPO)为实验室自制；分析级酵母粉和蛋白胨均为OXOID公司产品；工业级酵母粉为安琪酵母股份有限公司产品。其余试剂为国产分析纯。

1.3 发酵培养

种子培养：挑取平板上划线的重组大肠杆菌单菌落接种至种子培养基，37 ℃、200 r/min振荡培养7～8 h。

发酵培养：将培养好的种子液按2%的转接量转接至含50 mg/L卡那霉素的50 mL液体培养基中，37 ℃、200 r/min振荡培养3～4 h至OD600达到1.0时加入终浓度为0.5 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，18 ℃诱导14～16 h。收集发酵液4 ℃、12 000 r/min离心收集菌体，用pH 7.5的磷酸盐缓冲液重悬后破胞取上清液测酶活。

1.4 GluDH活力测定

高效液相色谱法检测L-草铵膦的生成量。

1.5 响应面法优化培养基组成

1.5.1 Plackett-Burman 设计[27]

通过Plackett-Burman试验来确定发酵培养基中影响酶活的主要组分因素。选用N=12的PB设计，每个因素分别取高、低两个水平，高水平取低水平的1.25倍，响应值为每毫升发酵液中谷氨酸脱氢酶的酶活。

1.5.2 响应面试验设计[28]

根据Box-Benhnken的中心组合实验设计原理，进一步进行三因素三水平的响应面分析实验，实验数据用Design Expert 软件经多项式回归分析，并对拟合方程做显著性检验，其统计学上的显著性由F检验确定。

2 结果与分析

2.1 最适碳源、氮源的选择

碳源的选择：以10 g/L的安琪酵母粉905作为氮源，在碳源浓度为5 g/L时对液体发酵培养基中的碳源进行筛选，实验结果见图2。由图2可知以甘油为碳源时的酶活力和OD600最高，分别为82.3 U/mL和6.81，表明甘油是最适碳源。

1:蔗糖；2:果糖；3:可溶性淀粉；4:葡萄糖；5:木糖；6:甘油

图2不同碳源下的酶活力和OD600

Figure 2 Enzyme activity andOD600for different carbon source

氮源的选择：以5 g/L的甘油作为碳源，在氮源浓度为10 g/L时对氮源进行筛选，实验结果见图3。由图3可知，以OXOID公司的酵母粉(分析级)为氮源时，酶活力和生物量OD600最高，安琪酵母粉905(工业级)为氮源时的酶活和生物量次之，考虑到安琪酵母粉在价格上有显著优势，因此采用安琪酵母粉作为氮源。

2.2 Plackett-Burman 筛选影响产酶的重要因素

在单因素优化实验结果的基础上，对培养基的7种组分(X1-甘油、X2-Na2HPO4·12H2O、X3-KH2PO4、X4-NaCl、X5-NH4Cl、X6-酵母粉、X7-MgSO4·7H2O)进行PB重要性筛选，实验设计与结果如表1所示。

利用Design Expert软件对各因素的主效应进行分析，结果见表2。由表2的分析结果可知，酵母粉(X6)、甘油(X1)和MgSO4·7H2O(X7)这3种因素的Prob>F值均小于0.05，表明这3种因素对产酶的影响极显著。另外模型方差分析的可信度R2=96.61%，证明该模型显著性极高,可对本研究模拟进行较好地解释。

1:酵母粉(OXOID)；2:胰蛋白胨(OXOID)；3:安琪酵母粉(905)；4:牛肉膏；5:大豆蛋白胨；6:骨蛋白胨；7:鱼蛋白胨

图3 不同氮源下的酶活力和OD600

表2 Plackett-Burman 试验因素水平及效应

2.3 最陡爬坡试验设计

对PB实验结果确定的3种显著性试验因素进行爬坡实验，使其浓度尽量靠近最佳水平值区域，试验设计及结果如表3所示。由结果可见，酶活随着各组分浓度的升高先增大后减小，酶活最高值在第4组与第5组实验之间，并且第4组的酶活较之更高，所以以第4组的条件作为最佳因素质量浓度的组合并作为下一步响应面实验的中心点，即酵母粉16 g/L、甘油11 g/L、MgSO4·7H2O 0.8 g/L，并根据上述结果，确定响应面试验中3种试验因素的3个水平值。

表3 最陡爬坡试验设计及其结果

2.4 Box-Behnken试验设计及结果

采用三因素三水平的Box-Behnken响应面分析法进一步对培养基进行优化，因素水平见表4，试验结果表见表5。

表4 响应面分析试验因素及水平

表5 培养基组成Box-Behnken试验设计和结果

2.5 模型方程的建立与方差分析

运用构建好的二阶经验模型来进行分析。对试验模型进行二阶回归拟合，得到回归方程为：

表6 Box-Behnken试验设计结果方差分析

注：“**”表示差异极显著，P<0.01；“*”表示差异显著，P<0.05；“—”表示差异不显著，P>0.05

模型的响应面图及其等高线图各变量与变量之间对响应值的影响，等高线图还可揭示出各变量之间交互作用的显著性[29]。在硫酸镁(X3)浓度保持固定的情况下，酵母粉(X1)与甘油(X2)对产酶的影响，如图4所示，图5与图6同理。

图4 响应面法(X1，X2)立体分析及等高线图

2.6 重组大肠杆菌产GluDH最优培养基成分的确定

对模型方程进行典型性分析说明，模型存在最优的极值条件，即在相应曲面的最高点处，通过分析可以得到GluDH的最大产出和各显著因素添加的最佳质量浓度：安琪酵母粉905 16.28 g/L，甘油11.3 g/L，MgSO4·7H2O 0.63 g/L，预测GluDH 活力的最大值为129.3 U/mL。

为证明模型预测的准确性，进行3次平行最优条件下的重复试验，结果分别为128.7、128.9和129.6 U/mL，平均值为129.1 U/mL，与模型方程预测结果基本一致，这说明模型方程真实可行，能够很好地预测实际的发酵结果。

图5 响应面法(X1，X3)立体分析及等高线图

图6 响应面法(X2，X3)立体分析及等高线图

3 讨论

响应面优化法是将数学方法与统计方法相结合，寻求多因素系统中的最佳条件，对受多个变量影响的响应问题进行建模与分析，缩短优化时间，提高应用的可信度。该方法实验次数少，周期短，精度高，已成功地应用于其他发酵培养基的优化，但目前还未有将该方法应用于谷氨酸脱氢酶重组菌的发酵培养的报道。首先通过单因素试验对发酵培养基中最适的碳源和氮源进行筛选，从工业生产成本和酶活两个角度考虑，以甘油作为碳源和以安琪酵母粉905作为氮源能获得较高的酶活，并且具有价格优势，能显著降低工业化生产的成本。

不同的培养基成分及含量对酶活有不同程度的影响，因此选择通过Plackett-Burman设计结果分析确定对酶活影响显著的培养基成分，对培养基中的不同组分分别设计高、低两个不同水平(高水平为低水平的1.25倍)，通过Design Expert软件设计实验，以酶活为响应值，对实验结果进行方差分析，由P值可知影响显著的3个因素分别为安琪酵母粉905、甘油和MgSO4·7H2O。为了进一步逼近响应值酶活的最佳区域，确定响应面实验点的取值范围，设计最陡爬坡实验得到酶活的变化趋势，并确定一组最高的酶活所对应的培养基组分浓度作为响应面实验的中心点。最后对响应面实验结果进行建模和方差分析，得到二阶回归方程，分别对3个因素一次项、二次项和交互项影响的显著性进行分析，得到酵母粉和甘油的一次项和二次项均影响显著，交互项影响不显著，即各因素之间交互作用的影响较小。同时可得到响应面图及对应的等高线图，从各等高线图可知，各自变量因素之间的交互作用不显著，从响应面图可知最大椭圆表示在该圆上取值，酶活最低，产量最小；而最小椭圆取值，酶活最高，产量最大，大小椭圆之间酶活逐渐递进。对模型进行分析，酶活的最优值在曲面的最高处取得，得到预测最高值为129.3 U/mL，通过实验验证，所得的酶活值与预测值基本一致，说明模型有效可靠。

本文采用的是Plackett-Burman试验设计和响应面分析法结合对发酵培养基进行优化，目前还未有将该方法应用于谷氨酸脱氢酶重组菌的发酵培养的报道。通过响应面确定最佳的培养基配方为：甘油11.3 g/L，安琪酵母粉905 16.28 g/L，MgSO4·7H2O 0.63 g/L，Na2HPO4·12H2O 17.1 g/L， KH2PO43 g/L，NH4Cl 1.5 g/L，NaCl 0.5 g/L。采用优化后的培养基，摇瓶发酵产谷氨酸脱氢酶的酶活达到129.1 U/mL，是LB培养基酶活的2.58倍。结果证明Plackett-Burman和响应面法结合的试验统计方法能比较快速地找出显著的影响因素，并实现培养基组分优化，优化结果与实际发酵条件吻合良好，谷氨酸脱氢酶产量提高显著。本试验成功地提高了谷氨酸脱氢酶的生产效率，为胺化还原制备L-草铵膦的工业化应用奠定了基础。