乙型流感病毒抗原快检试剂应用评估

李艳宇 李姗姗 高鹏 彭晓旻

流感病毒依据内部核蛋白(NP)与基质蛋白(MP)的抗原性差异，可被分为甲型(A)、乙型(B)和丙型(C)三个型。甲型和乙型流感病毒是人群中主要的流行病毒，是引起人群呼吸道感染的主要病原体。乙型流感病毒虽然未造成过流感大流行，但同甲型流感病毒一样每年在全球季节性流行，导致了各地的局部流行，并能引起重症和死亡病例，在某些特定情况下所导致的疾病负担甚至超过甲型流感病毒[1-3]。乙型流感病毒属于正黏病毒科(orthomyxoviridae)，本研究用乙型流感病毒快速检测方法与实时荧光参考方法进行比较，拟评估乙型流感病毒快检试剂盒在基层医疗机构的适用性及应用效果，为临床推广提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1评估样本来源 2015年10月-2017年5月，以北京市东城区疾病预防控制中心(CDC)收集到的216例流感样病例的咽拭子标本作为本次评估的临床样本，其中，流感样病例定义为发热(体温≥38 ℃)，伴咳嗽或咽痛之一者。

1.2标本采集、保存和运输 用无菌咽拭子在患者咽后壁左右擦拭至少2次，然后将其放置病毒采样管中，4 ℃条件下运输。24 h内进行检测则放置2～8 ℃条件下，超过24 h检测则需要放置-80 ℃冻存。

1.3评估试剂及操作步骤 乙型流感病毒抗原检测试剂盒(免疫渗漏法)为北京万泰生物公司产品(货号为：Flu-0330)。操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。操作过程中应注意：(1)在样本处理时，加入裂解液后一定要充分混匀，使样本充分裂解。(2)加酶标试剂后一定要等酶标试剂完全渗入后再静置2 min进行下一步操作，使酶作用时间充足。

1.4参照方法及检测流程 以中国疾病预防控制中心推荐的乙型流感病毒实时荧光PCR方法作为对照方法。检测流程：(1)引物与探针序列：FluB-F：TCCTCAACTCACTCTTCGAGCG；FluB-R：CGGTGCTC-TTGACCAAATTGG；FuB-P：CCAATTCGAGCAGCTGAA-ACTGCGGTG。(2)体系配制采用QIAGEN的Quantitect©Probe RT-PCR kit：货号为204445。(3)上机程序：设置FAM荧光通量，反转录50 ℃ 30 min；95 ℃ 15 min；94 ℃ 15Sec、60 ℃ 60Sec(40个循环，并在60 ℃收集荧光)。(4)结果判读标准：以阴性对照的扩增曲线作为基线调整依据，阈值循环数Ct(cycle threshold)值<30为阳性；Ct值>32为阴性；Ct值在30～32之间为灰区，重新检测后Ct值仍在30～32之间判为阳性。

1.5分析方法 临床试验采用样本随机盲法排序。(1)在测定过程中，对同一份标本分别用乙型流感病毒抗原快检试剂盒(免疫渗漏法)和参照方法平行测定，分别记录实验结果。(2)将两种检测方法均为阳性且Ct值较低(Ct值>29)的样本按照10倍梯度稀释10-1～10-4，然后再用快检方法与参考方法分别对各个稀释度的样本进行平行测定，分别记录实验结果。

1.6统计学方法 采用医学统计学2×2列联表，用SAS 9.3统计软件对数据进行Kappa值检验，评价快检方法与参考方法的一致性(Kappa值为内部一致性系数，是评价诊断试验方法与金标准一致性指标。判别标准为：Kappa值≥0.75说明两个判断值具有良好的一致性； Kappa值>0.4，说明两个判断值一致性尚可； Kappa值≤0.4说明两个判断值一致性较差；)，两种检测方法间的差异用Fisher检验；同时评价快检试剂的灵敏度、特异性、总符合率指标。灵敏度=真阳性份数/(真阳性份数+假阴性份数)×100%，特异性=真阴性份数/(真阴性份数+假阳性份数)×100%，总符合率=(真阳性份数+真阴性份数)/总份数×100%。

2 结果

2.1快检方法与参考方法检测结果的比较 用乙型流感病毒快检方法与实时荧光参考方法同时检测临床216份流感样病例样本，统计结果显示 Kappa值为0.91，表明两种检测方法的一致性良好，Fisher检验P=8.44E-17，P<0.001，两种检测方法差异有统计学意义。其中快检方法的灵敏度为84.62%(11/13)，特异性为100%(203/203)，总符合率为99.07%(214/216)。两种方法均表现为阳性的人数为11份(8份为快检阳性参考方法检测Ct值<30，3份为快检阴性参考方法检测两次Ct值都在30～32之间)，有2份样本快检方法检测为阴性而参考方法检测为阳性(参考方法两次检测Ct值都在30～32之间,表1)。

2.2快检方法与参考方法检测限度的比较 两种检测方法均为阳性且Ct值较低(Ct值>29)的5份流感样病例样本稀释后再用乙型流感病毒快检方法与实时荧光参考方法同时检测，结果显示有4份样本检测阳性限度相差10倍，1份样本检出阳性限度相差100倍，第5件样本在稀释度为10-3时两种检测方法均为阴性(其样本Ct值最高为31.57,表2)。

表2 快检方法与参考方法检测限度比较

注：“+”表示检测结果为阳性；“-”表示检测结果为阴性。

3 讨论

3.1结果发现，乙型流感病毒快速检测试剂与实时荧光PCR检测方法比较，也能高特异、高敏感地检测出乙型流感病毒感染，并且与对照试剂有着较高的符合率，说明乙型流感病毒快检试剂也可以满足乙型流感病毒临床检测的一般需要。本研究中虽然只有2份样本呈现假阴性结果，但由于近几年乙型流感病毒病例相对较少，只有13份阳性样本，所以漏检率较高，灵敏度相对较低，防止出现这种偏倚的方法一方面需要选择在乙型流感流行的年度加大检测样本，提高乙型流感病毒的阳性率，另一方面是快检试剂本身质量的优化，缩短样本裂解时间，降低样本检出浓度限度，提高试剂的灵敏度和特异性。

3.2由于无合适的方法对样本中病毒载量进行绝对定量，只能对原始样本进行相应的梯度稀释后再用两种方法同时进行检测，以评估快检方法的检测限度。通过检测结果发现，快检方法与参考方法的检测限度一般只相差10倍(只有一份样本相差100倍)，说明快检方法的检测限度也较低，与普通PCR方法相当[4-7]。但快检试剂对样本的检出限度值与参考试剂检测样本的Ct之间是否存在线性关联还需要进一步研究。

与参考试剂相比，快检试剂有着检测时间短、操作简单、不需要检测仪器等诸多优点，其特异性和灵敏度较高，可为临床医生对乙型流感病毒感染及病毒性肺炎的病原学诊断、制定诊疗方案提供帮助。