一起霍乱疫情分离株的耐药性和分子流行病学分析

王云霞 严寒秋 刘海波 史文凤 周海健 王斌

2017年7月，北京市房山区疾控中心接到辖区某医院疑似霍乱病例的报告，通过流行病学调查和实验室检测，最终确定其病原菌是O1群小川型霍乱弧菌，CT(cholera toxin)毒素阴性，溯源表明疫情与厨师有关。现分析该起霍乱疫情分离株的耐药性和分子流行病学特征，为霍乱疫情防控提供可借鉴的经验。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1样本来源：样本来自疫情中采集的患者便标本1件、密切接触者肛拭子37件(家属3件,其他密接34件)、患者就餐地厨师肛拭子4件、患者就餐地后厨外环境和食物原料等各种涂抹67件，共109件样本，均放置pH=8.8碱性蛋白胨水增菌液中，常温保存，立即送检。

1.1.2试剂：碱性蛋白胨水和庆大霉素平板购自友康恒业生物科技(北京)有限公司，霍乱弧菌血清购自泰国S&A REAGENTS LAB公司和郑州万泰生物科技有限公司，霍乱弧菌O1/O139群和霍乱弧菌 CTX基因核酸检测试剂盒购自江苏硕世生物科技股份有限公司；革兰阴性需氧菌药敏检测板购自上海星佰生物技术有限公司；限制性内切酶NotI、SfiⅠ购自美国NEB公司。上述试剂均在有效期内使用。

1.1.3仪器：瑞士Roche LightCycler 480实时荧光定量PCR仪；美国Bio-rad CHEF Mapper system脉冲场凝胶电泳仪；美国Bio-rad Gel Doc 2000凝胶成像系统；上海星佰生物技术有限公司微生物鉴定药敏分析系统。

1.2方法

1.2.1病原菌常规分离培养: 按《霍乱防治手册》(第6版)和《霍乱诊断标准》(WS 289-2008)对109件样本进行增菌、分离培养、玻片凝集实验和生化鉴定[1-2]。

1.2.2霍乱弧菌实时荧光PCR法: (1)实时荧光PCR检测霍乱弧菌O1/O139群特异性基因：取37 ℃培养6 h的碱性蛋白胨水增菌液2 mL，于无菌2 mL离心管中，共109件样本。用德国Minispin plus 12 000 r/min离心3 min，弃上清留沉淀。在该离心管中加入1 mL DEPC水，使管中沉淀悬浮均匀，再次同上离心弃上清留沉淀。在该离心管中加入130 μL DEPC水，使沉淀悬浮均匀后100 ℃加热10 min，12 000 r/ min 离心10 min，取上清100 μL为基因组DNA，-20 ℃保存备用。使用霍乱弧菌O1/O139群核酸检测试剂盒，进行实时荧光PCR法检测霍乱弧菌O1/O139群特异性基因，操作按试剂盒说明书进行。荧光曲线Ct值≤35 且曲线呈“S”形判为阳性，提示样本中含有O1或O139群霍乱弧菌；否则阴性,提示样本中不含有O1或O139群霍乱弧菌。(2)实时荧光PCR检测霍乱弧菌CTX基因：常规分离培养阳性的菌株接种LB琼脂，37 ℃培养过夜，挑取LB平板上的单菌落于130 μL DEPC水中，采用上述水煮法提取基因组DNA。使用霍乱弧菌CTX基因核酸检测试剂盒,进行实时荧光PCR法检测霍乱弧菌CTX基因，操作按试剂盒说明书进行。荧光曲线Ct值≤35且曲线呈“S”形判为阳性，提示样本为产毒株；否则阴性，提示样本为非产毒株。

1.2.3药物敏感试验: 采用96孔微量肉汤稀释法进行药物敏感试验，试验药物共20种：氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、四环素、氯霉素、复方新诺明、头孢唑林、头孢噻肟、头孢他啶、头孢西丁、庆大霉素、亚胺培南、阿奇霉素、环丙沙星、阿莫西林/克拉维酸钾、阿米卡星、头孢吡肟、美罗培南、左氧氟沙星、多西环素(强力霉素)和链霉素。药敏板上倍比稀释浓度单位为μg/mL，挑取LB平板37 ℃培养18 h的纯菌，置于2 mL灭菌生理盐水中，配(0.52±0.2)麦氏单位的菌悬液(浓度约1.5×108cfu/mL)，药敏板35 ℃培养19 h，结果判断等其余操作均按上海星佰生物技术有限公司微生物鉴定药敏分析系统操作说明书进行。

1.2.4脉冲场凝胶电泳(PFGE)实验及聚类分析: 参照国家致病菌识别网和Pulse Net China监测网络中霍乱弧菌PFGE标准方法进行PFGE[3]。菌悬液浓度为4.2～4.4麦氏单位，54 ℃水浴细菌裂解1 h，DNA用内切酶NotI和SfiI酶切4.5 h,酶切温度分别为37 ℃和50 ℃。脉冲场凝胶电泳条件：2～10 s，13 h； 20～25 s，6 h。电泳前加硫脲(终浓度为38 μL/100 mL)，电泳后染色0.5 h，普通水脱色1.5 h，用凝胶成像系统照相，把胶块放在调准网格线内，使胶块的加样孔和调准网格线的最上面一条蓝线对齐,获取合格的图像。分子量标准为沙门菌H9812。用BioNumerics(Version 5.01)软件对图像进行处理,用UPGMA(unweighted pair group method using arithmetic averages)方法构建聚类树。

2 结果

2.1霍乱弧菌O1/O139群特异性基因结果 109件样本增菌液,使用实时荧光PCR法检测O1/O139群霍乱弧菌特异性基因，O1群霍乱弧菌特异性基因阳性21件，其中患者便标本阳性1件，密接中家属肛拭子阳性1件,患者就餐地厨师肛拭子阳性1件,患者就餐地后厨外环境各种涂抹阳性18件，阳性率19.27%；109件样本增菌液O139群霍乱弧菌特异性基因均为阴性。初步可判断该疫情为O1群霍乱弧菌引起。

2.2常规分离培养结果 109件样本进行常规培养及鉴定,检出6株O1群小川型霍乱弧菌(均从荧光PCR法阳性样本中分离，另外15件荧光PCR法阳性样本中未检出霍乱弧菌),其中患者便标本检出1株，患者就餐地厨师肛拭子检出1株，患者就餐地后厨外环境各种涂抹检出4株，阳性率5.50%；109件样本均未检出O139群霍乱弧菌。

2.3实时荧光PCR检测霍乱弧菌CTX基因结果 6株O1群小川型霍乱弧菌,使用实时荧光PCR法检测霍乱弧菌 CTX基因。6株菌均为霍乱CTX基因阴性，为非产毒株。

2.4药物敏感试验结果 对6株O1群小川型非产毒株霍乱弧菌进行了20种抗生素药敏试验，四环素、氯霉素、复方新诺明、头孢西丁、庆大霉素、亚胺培南、阿奇霉素、环丙沙星、阿米卡星、美罗培南、左氧氟沙星和多西环素(强力霉素)共12种抗生素100%敏感，头孢唑林(为头孢一代)100%耐药,头孢噻肟和头孢他啶(为头孢三代)和头孢吡肟(为头孢四代)出现了部分耐药(表1)。

表1 6株O1群霍乱弧菌对20种抗生素的药敏试验结果(株)

2.5PFGE分子分型结果 对6株O1群小川型非产毒株霍乱弧菌(2017HL002-007)用NotI和SfiⅠ 酶切，进行PFGE分子分型，图谱用BioNumerics软件分析，并通过与Pulse Net China霍乱弧菌PFGE分型数据库进行比对，NotI和SfiI酶切的电泳图谱均为唯一带型，分别命名为KZGN11O1.CN1217 和KZGS12O1.CN0548。此次疫情分离的6株菌呈现的条带相似度系数为100.0%，与2017年北京市分离的其余3株O1群霍乱弧菌相似度系数为70.0%(条带数差异大于10条,图1)。

注：菌株BJ2017HL002-BJ2017J007是本次疫情分离菌株；BJ2017HL001、BJ2017HL008、BJ2017HL009是北京市2017年其他霍乱疫情分离菌株。图1 NotI和SfiⅠ酶切6株菌在北京市2017年霍乱弧菌PFGE数据库中的分型结果

3 讨论

3.1霍乱弧菌中O1/O139血清群霍乱弧菌可引起急性肠道传染病，CT为霍乱弧菌主要毒力因子，是目前已知致泻毒素中最强烈的一种[1]。2007-2014年，北京市霍乱弧菌日常监测中检出的125株O1群霍乱弧菌以小川型非产毒株为主导[4]，国内其他省市也有非产毒株引起腹泻疫情报道[5]，此次疫情也是非产毒株引起。因此，在霍乱弧菌常规监测中应提高对非产毒株的重视。

3.2霍乱弧菌疫情报告有着极高的敏感性，传统培养法耗时长、工作量大、灵敏度低，且容易造成漏检。目前,更加快捷的分子生物学技术已广泛应用于病原微生物检测中[6-8]，LYON[9]利用Real-time PCR 探针法检测霍乱弧菌hlyA基因，仅用3 h，且最低检测灵敏度达到了 8 cfu/g(粪便样)、10 cfu/mL(水样)。本次疫情先采用荧光定量PCR法检测109件样本增菌液,共有21件样本O1群霍乱弧菌特异性基因阳性，得以快速锁定目标病原菌为O1群霍乱弧菌。在后期分离培养中，109件样本检出6株O1群小川型霍乱弧菌，均从荧光PCR法阳性样本中分离得到，另外15件PCR法阳性的样本及88件PCR法阴性的样本，均未检出霍乱弧菌。由此可见，荧光定量PCR法和经典的分离培养法有机结合，能快速确定病原菌，这与有关报道是一致的[10]。

3.3对6株霍乱弧菌进行抗菌药物敏感性分析,结果显示这6株霍乱弧菌对20种药物中的12种100%敏感，对头孢唑林(为头孢一代)100%耐药,可作为对此次疫情相关病例及带菌者进行药物治疗的依据；另外，6株霍乱弧菌对头孢噻肟和头孢他啶(为头孢三代)及头孢吡肟(为头孢四代)出现部分耐药，二代头孢霉素头孢西丁其母核与头孢菌素相似，抗菌活性与头孢二代相似，但是试验结果100%敏感。所以下一步应对这6株菌耐药基因和耐药整合子是否有差异进行深入研究[11]，从分子水平阐明其耐药特性。

3.4PFGE是致病菌引起的疫情溯源的“金标准”,有报道对NotⅠ和SfiⅠ进行了深入的比较研究，认为同时使用两种酶更能从多角度准确的研究菌株间相关性[12]。此次疫情流调报告为O1群小川型霍乱弧菌阳性的厨师未出现腹泻症状，呈健康状态。此次疫情，后厨的水池、加工台面、洗鱼池及餐盘涂抹标本分离的4株菌同患者和厨师分离的2株菌，应用了NotⅠ和SfiⅠ两种酶进行酶切，依据PFGE图谱结果，其相似度系数为100.0%，具有一致性，即高度同源，与2017年北京市数据库中的其他菌株相似度系数为70.0%，亲缘关系相差较远。所以推测健康带菌厨师为此次疫情的传染源，在工作中污染了后厨的环境，最终感染了患者。因此，在霍乱流行季节，应强化日常监测，特别是加强餐饮从业人员健康体检，有效切断健康带菌者这一传染源，同时普及食品安全教育，从多方位预防霍乱疫情的发生。