金银花-连翘药对抗肠道病毒71型的初步探究

黄培成，杨 强，程小耕，高秀容，文 燕，张玉琴

0 引言

肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)，属于小RNA病毒科肠道病毒属，可通过诱导细胞凋亡造成严重的神经系统、呼吸系统和循环系统并发症，甚至导致死亡，已成为临床手足口病的常见和危重的病原体[1-2]。近年来，EV71爆发流行仍呈上升的趋势，目前尚无特效的药物，只能对症治疗。因此,探求特异性抗 EV71 病毒药物迫在眉睫。

传染性疾病在中医学上属于“时疫”、“温病”的范畴，主要采取清热、解毒的治疗原则。金银花、连翘作为清热解毒的常用药对，现代研究表明其具有抗炎、抗菌、抗病毒、解热等药理活性，广泛应用于临床[3-5]。据不完全统计，上市的中成药中含有“银翘”药对(Floslonicerae-fructusforsythiaeherb couples，F-FHC)的处方超过120个，涉及的相关制剂460多个，如双黄连、银翘胶囊、金地蓝消毒片、复方芩兰口服液等。此外，在手足口病诊疗指南(2018年版)中，F-FHC作为常用药物多次被提及。鉴于此，本文结合体内体外初步评价F-FHC抗EV71的作用。

1 材料与仪器

1.1 药品和试剂 金银花、连翘购于成都市荷花池中药材市场，经成都中医药大学王光志教授鉴定，符合《中国药典》2015年版一部金银花、连翘项下有关规定。利巴韦林片(湖南正清制药集团股份有限公司，批号：1807106)。DMEM培养基、胎牛血清、胰酶、青霉素和链霉素均购自美国Sigma公司；二甲基亚砜(DMSO)和甲基偶氮唑蓝(MTT)购自上海生工生物工程公司。

1.2 试验动物、细胞及病毒 SPF级1周龄KM乳鼠，雌雄各半，体重(20±2)g[成都达硕实验动物有限公司，动物合格证号:SCXK(川)2015-030]。室温维持在(24±2)℃，自由摄食与饮水，适应2 d后进行实验。人子宫颈癌细胞(Hela)(上海生命科学院细胞库)；EV71由四川省疾控中心惠赠。

1.3 试验仪器 CO2培恒温养箱(HF90，上海力申科学仪器有限公司)；BH2荧光倒置显微镜(奥林巴斯光学仪器公司)；PHOMO酶标仪[安图实验仪器(郑州)有限公司]。

2 方法

2.1 F-FHC提取物的制备 取金银花、连翘(质量比金银花∶连翘=1∶1)各50 g，加10倍量的水，煎煮2次，每次1 h，过滤后合并滤液，并浓缩至1 g/ml(按生药计)，0.22 μm微孔滤膜过滤，灭菌，4 ℃冰箱保存备用。

2.2 EV71病毒TCID50测定 取Hela细胞(1.0×104个/ml)接种于无菌96孔培养板，100 μl/孔，放置35 ℃、5% CO2培养箱中24 h，待细胞长成单层后，吸取上清液。将病毒按10-1～10-8依次稀释，每孔100 μl接种在96 孔板上，每个浓度设8个复孔，前后左右轻摇几下，同时另设正常细胞对照和空白对照，于37 ℃、5% CO2培养箱培养72 h。倒置显微镜下观察细胞的形态及变化，并记录，计算病毒液的半数感染浓度(TCID50)。

2.3 细胞Hela毒性实验(MTT法)[6]取Hela细胞(1.0×104个/ml)接种于无菌96孔培养板，100 μl/孔，放置35 ℃、5% CO2培养箱中24 h，待细胞长成单层后，吸取上清液。用培养液将药物按2倍比稀释7个浓度梯度，依次接种于96孔板中，每个药物浓度4孔，并设不加药物细胞和培养液空白为对照，于35 ℃、5% CO2培养箱中，继续孵育。48 h后，吸尽培养液，每孔加入5 mg/ml的MTT溶液10 μl，继续孵育4 h，用移液枪慢慢吸取上清液，加入DMSO 150 μl，轻轻振荡使其溶解。用酶标仪测定490 nm处的OD值，计算F-FHC对RD细胞的半数有毒浓度(TC50)。

2.4 药物不同处理方式体外抗病毒评价[7]评价内容分为同时加病毒和药物组(A组)及病毒感染后加药组(B组)。用“2.2”项下方法在96孔培养板中接种和培养单层细胞24 h后，A组：不同浓度的药物与100 TCID50的EV71混合，于37 ℃作用 2 h，随后加入 96 孔板培养 48 h；B组：加入100 TCID50的EV71，轻混，35 ℃吸附1.5 h后，加入不同浓度的药物，继续孵育48 h。各孔加液量、培养条件、MTT法等内容同“2.2”项，最终计算药物半数有效浓度(IC50)。

2.5 药物体内抗病毒评价 取KM乳鼠若干，雌雄各半，经腹腔注射20 μl EV71，通过婴儿电子体温计检测到体温上升和部分取血ELISA试剂盒检测到病毒呈阳性，说明造模成功[8]。感染后小鼠随机分为病毒对照组、利巴韦林组(2 mg/ml)以及F-FHC高、中、低剂量组[按生药计，分别为3.0、1.5、0.75 g/(kg·d)]，并设正常对照组(未注射EV71)，每组10只。

造模成功4 d后，各给药组连续灌胃10 d，每天1次，病毒对照组和正常对照组则灌胃给予等体积的生理盐水。观察动物症状体征的变化及死亡率，并记录每日体重、体温。在10 d后，小鼠脱颈处死，剖腹取出心脏，放入体积分数10%福尔马林溶液中固定。用常规石蜡包埋，切片，HE染色，制备成病理切片，光镜下观察心脏组织病理学变化情况。

3 结果

3.1 药物细胞毒性评价 采用Reed-Muench法计算EV71 TCID50为10-3.23/ml，在后续实验中用100 TCID50作为病毒液浓度。由图1可知，F-FHC对Hela细胞的细胞毒性随浓度的减小平行减弱。当浓度为1/64(15.6 mg/ml)时，细胞存活率接近100%，此浓度可作为体外抗病毒评价的最高给药浓度，而TC50为123.3 mg/ml，因此，F-FHC的安全范围很广。

图1 F-FHC对Hela细胞的毒性作用

3.2 不同处理方式体外抗EV71作用 由表 1 可知，F-FHC不同方式处理EV71 孵育48 h 后，均可提高Hela细胞的存活率，对病毒产生一定的抑制作用，并呈现出一定程度上的剂量依赖关系。此外，A组的IC50为8.65 mg/ml，B组的IC50为12.17 mg/ml，说明F-FHC对EV71的直接抑制作用强于治疗作用。由图2可见，正常细胞组(图2A)活细胞数目较多，生长情况良好，细胞体积较大，比较均一。感染EV71后(图2B)活细胞数目明显减少，细胞形态逐渐变圆变小，细胞质浓缩，出现死亡。但无论哪种处理方式，给予F-FHC处理后，活细胞数目明显增多(图2C)。

表1 F-FHC不同处理方式对EV71的抑制作用

3.3 体内抗EV71作用

3.3.1 一般体征观察 感染后的第3天，所有小鼠均出现低热、精神萎靡、活动减少、拒食、体重下降，说明造模成功。病毒对照组感染第5天后逐渐伴有竖毛、弓背、体型减小等症状，感染第7天出现嗜睡、死亡率明显上升。而不同浓度的F-FHC治疗后各种症状都有所缓解，特别在治疗4 d后，体重开始回升，治疗10 d后，中、高剂量组与正常对照组差异无统计学意义，效果接近利巴韦林。低剂量组出现了部分小鼠死亡。

3.3.2 组织镜检 由图3可知，正常对照组心肌组织未见炎性细胞浸润及坏死灶，细胞排列整齐，呈圆柱状，胞核卵圆，位于细胞中央(图3A)。而病毒对照组心脏组织结构出现了部分紊乱，伴有炎症细胞浸润，但未见明显组织坏死(图3B)。F-FHC中、高剂量组与利巴韦林组效果类似，心脏组织形态与正常对照组无明显差别。

4 讨论

手足口病主要是由EV71和柯萨奇病毒A组16型(CV-A16)等肠道病毒引起的，多见于学龄前儿童。该病主要临床表现为发热、手足部发生红色斑丘疹、口腔黏膜等部位溃疡，严重者可引起脑干脑炎及神经源性肺水肿[9-10]。由于其隐性感染比例大、传播途径复杂、传播速度快，在短时间内可造成较大范围的流行，已按丙类传染病管理。目前，手足口病诊疗指南和治疗方案日趋成熟，病死率也得到了有效控制，但如何有效地缩短病程、减轻临床症状、提高总体疗效等尚不明确。西医综合治疗方案包括足量激素抗炎、甘露醇脱水保护脑细胞、免疫球蛋白提高免疫力以及对症支持治疗。临床疗效观察显示，该方案既有优势，也有自身局限性，包括退热效果不理想、重症患者病程时间仍然较长、使用免疫球蛋白经济压力大等[11]。随着研究的深入，中医药防治手足口病的优势逐渐显现。

图2 F-FHC不同处理方式对 EV71 的抑制作用

图3 心脏组织病理形态学(200×)

EV71是引起手足口病重症病例的主要因素[12]，危害极其严重，已受到社会广泛关注。EV71 无包膜，对去污剂、乙醚、脱氧胆酸盐及弱酸处理不敏感，且 EV71 在病毒复制过程中易产生突变[13]，给EV71 的预防及治疗造成了极大的困难。目前，临床上普遍使用利巴韦林、阿昔洛韦等广谱的抗病毒药物。这些药物虽然对症状有所缓解，但毒副作用明显，针对性不强，安全性不高[14-15]。临床上仍缺乏特效的、专一的、机制明确的抗 EV71药物。许多单味中药和复方通过直接抑制病毒复制、增强宿主免疫功能、抗炎等多途径、多靶点、多环节的共同作用机制，在抗病毒方面已显示出了独特的优势，如甘露消毒丹、双黄连、升麻葛根汤等[16-17]。

中医认为，手足口病乃由外感时邪、湿热内蕴、内外熏蒸、郁结肌表而成，属于温病的范畴。金银花、连翘均有清热解毒功效，二者同用效果更强更专，已广泛用于抗SARS病毒和甲流H1N1等传染病中，收效甚佳[18]。现代研究表明，二者均有抗菌、抗炎、抗病毒、增强机体免疫力等药理作用，合用药效更好[19-20]。本试验结合体内体外的方法初步确定了F-FHC抗EV71的作用，并呈现出一定程度上的剂量依赖关系。体外不同方式处理试验中发现，同时加入药物和病毒组比感染后加药物组的作用更强，可能是由于F-FHC阻止了病毒对细胞的吸附和传入，防止由感染细胞向未感染细胞侵染，并兼有一定的直接杀灭作用。体外实验表明；F-FHC能改善感染小鼠的体征和心脏病理变化，可能与增强宿主的免疫力有关。此外，临床研究显示，将F-FHC配伍的中药与西药联合使用，往往效果更佳[21]。