离子交换固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定水产品中泰妙菌素和沃尼妙林残留量

2019-08-15宗婧婧严忠雍张小军李停停高学慧

浙江大学学报（理学版） 2019年4期

宗婧婧，严忠雍，张小军 *，李停停，高学慧

（1.浙江海洋大学食品与医药学院，浙江舟山316021；2.浙江省海洋水产研究所，浙江舟山316021）

泰妙菌素(tiamulin，TML)[1]和沃尼妙林(valnemulin，VLM)[2]是截短侧耳素类半合成的动物专用抗生素，均属于双萜类[3]，结构中含有八元环、五元环上的羰基、C-11位上的羟基和C-14位上酰基等基团，见图1。该类抗生素通过抑制菌体蛋白的合成对革兰氏阳性菌及支原体起抗菌作用[4-6]，具有抗菌活性强、治疗效果显著、休药期短和使用安全性高等特点。在水产养殖业中，滥用这2种抗生素会导致其在水产品中大量残留，最终通过食物链危害人类健康[7-10]。我国是水产养殖大国，水产品安全是全民关注的重点。为了避免泰妙菌素和沃尼妙林等药物残留，保证水产品的质量安全，有必要建立一种水产品中泰妙菌素和沃尼妙林残留量的检测方法。

图1 泰妙菌素和沃尼妙林结构式Fig.1 Structural formula of tiamulin and valnemulin

泰妙菌素和沃尼妙林是弱碱性化合物，采用强阳离子固相萃取净化技术，将其锁定在强阳离子交换点，降低由蛋白质和脂质等成分引起的基质效应。这样不仅避免了对目标物定性的影响，还保证了方法的准确性和高效性。目前，国内外对这2种抗生素的检测方法主要有气相色谱法(GC)[11]、高效液相色谱法(HPLC)[12-15]和高效液相色谱-串联质谱法(HPLCMS/MS)[16-20]等。气相色谱法需要衍生化，步骤复杂，操作烦琐；高效液相色谱法虽然操作简便，但受基质的影响较大，灵敏度低，检测限高；而超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)[21-24]具有高效准确、灵敏度高和检出限低等优点。目前，UPLCMS/MS法检测泰妙菌素和沃尼妙林多以畜禽肉类为检测源，对水产品的检测较少，此方法的前处理步骤较为复杂，耗时较长。本研究采用强阳离子交换固相萃取柱净化结合UPLC-MS/MS法，操作简便、快速准确，与已报道的方法相比，本方法前处理用时更短、检出限低、灵敏度高，更适合日常大批量样品的筛查检测。经综合考虑，本实验考察了色谱和质谱条件，并优化了前处理提取和净化方法，建立了一种UPLC-MS/MS同时测定水产品中泰妙菌素和沃尼妙林残留量的分析方法。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

实验用草鱼、鲫鱼、对虾和梭子蟹各10 kg，均购自浙江舟山市临城水产批发市场。经超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)检测，样品均不含泰妙菌素和沃尼妙林药物残留。

泰妙菌素(tiamulin)、沃尼妙林(valnemulin)和泰妙菌素内标(Tiamulin-13C4Fumarate)均购自美国Sigma公司；Oasis MCX(3 mL，60 mg)固相萃取柱购自美国Waters公司；实验用水为Milli-Q高纯水；甲醇、乙腈、甲酸、乙酸铵和正己烷均为色谱纯，氨水为分析纯。

1.2 主要仪器与设备

ACQUITYTM型超高效液相色谱仪、Waters Xevo TQS四极杆质谱仪(配电喷雾离子源)、ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱 (2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，美国 Waters公司；MS2漩涡混合器，德国IKA公司；Centrifuge 5810高速离心机，德国Eppendorf公司；N-EVAP112氮吹仪，美国Organomation公司；VisiprepTMDL固相萃取装置，美国Supelco公司；超声波清洗器SK8200GT，上海科导超声仪器有限公司。

1.3 标准溶液配制

分别准确称取泰妙菌素和沃尼妙林标准品各5.0 mg(精确至0.1 mg)，用甲醇溶解并定容至50 mL，配置成 100 μg·mL－1的标准储备液，移取标准储备液各500 μL，用甲醇稀释并定容至50 mL，在室温下混匀配成1 μg·mL－1的混合标准中间液。再准确称取泰妙菌素内标1 mg(精确至0.1 mg)，用甲醇溶解并定容至 50 mL，配置成 20 μg·mL－1的泰妙菌素内标储备液。

将上述标准溶液4℃避光冷藏保存，使用时分别用乙腈逐级稀释成50 ng·mL－1的混合标准工作液和100 ng·mL－1的泰妙菌素内标工作液，且现配现用。

1.4 样品的提取与净化

1.4.1 提取

准确称取充分匀质的样品2.00(±0.01)g置于50 mL离心管中，加入100 ng·mL－1的泰妙菌素内标工作液50 μL用10 mL乙腈提取，涡旋30 s，超声10 min，7 000 r·min－1离心 5 min，最后将上清液转移至15 mL离心管中，待净化。

1.4.2 净化

取3 mL甲醇活化Oasis MCX固相萃取柱(3 mL，60 mg)，2%甲酸-水溶液平衡。取上述乙腈提取液过柱，依次用2%甲酸水溶液、甲醇和正己烷各3 mL淋洗Oasis MCX固相萃取柱，待淋洗结束后，将柱内残留液抽干，最后用3 mL7%氨水-甲醇洗脱液洗脱目标物，收集洗脱液，在50℃水浴中氮气吹干。加入1 mL含0.05%甲酸的5 mmol·L－1乙酸铵-乙腈(v/v=4：1)复溶，涡旋混匀，经 0.22 μm 有机相滤膜过滤后用UPLC-MS/MS检测。

1.5 色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；色谱柱温度：40 ℃；进样量：10 μL；流动相 A 为含 0.05%甲酸的 5 mmol·L－1乙酸铵水溶液，B 为乙腈；流速为 0.3 mL·min－1，梯度洗脱目标物。梯度洗脱条件如表1所示。

表1 梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution conditions

1.6 质谱条件

泰妙菌素和沃尼妙林经色谱柱分离，用质谱检测，选用电喷雾离子源正离子扫描(ESI+)，多反应监测模式(multiple reaction monitoring，MRM)，毛细管电压为3.5 kV，离子源温度为119℃，脱溶剂气温度为385℃，选择高纯氮气作为锥孔气和脱溶剂气，流速分别控制在55 L·h－1和800 L·h－1。在此质谱离子源条件下，泰妙菌素和沃尼妙林的质谱分析参数如表2所示。

表2 泰妙菌素和沃尼妙林的质谱分析参数Table 2 Mass spectrometry parameters of tiamulin and valnemulin

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的优化

2.1.1 提取液和固相萃取柱的选择

考虑实验水产品的含水率较高，样品基质成分复杂且较为分散，振荡提取的方式易导致基质分散黏壁造成目标物损失，因此选用超声提取方式。

为充分提取和净化，本实验参考文献[25-27]的提取液和固相萃取柱(solid phase extraction column，SPE)方法，分别进行乙腈和乙酸乙酯在MCX和HLB中的提取和净化，并根据回收率分析提取效果，结果如图2所示。由图1知，乙腈和乙酸乙酯提取泰妙菌素的效果均较好，回收率均在97%以上，但用乙酸乙酯提取沃尼妙林的回收率较低。乙腈提取液能同时将2个待测物提取完全，回收率分别为103.33%和90.31%。而且在实验过程中，用Oasis HLB SPE柱净化时，上样体积的增加造成色素逐渐沉积，导致流速变慢甚至堵塞，前处理耗时长。Oasis MCX SPE柱可以缩短样品前处理时间，提升净化效果。综合考虑，实验选用乙腈作为提取液，结合超声提取的方式，用Oasis MCX SPE柱净化。

2.1.2 提取次数的优化

结合2.1.1节的结果，进一步对比了10 mL乙腈提取1次和2次的区别。在草鱼阴性样本中加100 μL 50 ng·mL－1的混合标准溶液测其回收率。实验结果表明，提取1次基本能将目标物完全回收，回收率为92.21%，提取2次回收率为90.20%。这是由于2次提取液含水量不同，合并后溶液中有杂质析出，溶液变浑浊，导致净化时固相萃取MCX柱色素沉积甚至堵塞，回收率变低。因此，选择用10 mL乙腈提取1次。

图2 提取液和固相萃取柱对回收率的影响Fig.2 Effect of extract and solid phase extraction column on the recovery rate

2.1.3 洗脱液中氨水比例和洗脱体积的确定

考察了氨水-甲醇洗脱液中氨水比例和洗脱体积对回收率的影响。分别用1%，3%，5%，7%和9%的氨水-甲醇作为洗脱液，平均每mL取1次，共取4次，测其回收率。结果如图3所示，氨水的比例为7%时，洗脱能力强，回收率最高，分别为96.34%和97.07%，洗脱体积为3 mL时，基本能将目标物全部洗脱，随着洗脱体积的增大，后期不仅无目标物，而且会洗脱出其他杂质，干扰实验结果。因此,确定洗脱液为3 mL 7%氨水-甲醇。另外，考虑到水产品脂质含量高，在淋洗时加入正己烷，防止乳化现象的发生。

2.2 色谱条件的优化

采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)比采用常规液相色谱柱灵敏度更高，分析时间短，分离能力强。本实验用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱 (50 mm×2.1 mm，1.7 μm)测得待测组分的检出限为 0.03μg·kg－1，分析时间仅为5 min，结果基本不受基质的影响，能够在较短时间内达到最有效的分离。

在流动相中加入一定量的有机酸，可以提高待测组分的分离度和离子化程度，因此，为使灵敏度和分离度达到最佳，实验进一步考察了甲酸在流动相中的比例。分别在流动相中加入不同比例的甲酸溶液，结果如图4所示，以泰妙菌素为例，色谱图a、b、c、d和e中甲酸的比例分别为0.02%，0.05%，0.1%，0.2%和0.5%，色谱图c、d和e的响应值为1.77×107～1.91×107，较图a、b低，峰面积小而且有拖尾现象；色谱图b较色谱图a峰形尖锐，灵敏度和响应值相对较高，因此实验将甲酸比例优化为0.05%。

图3 洗脱液中氨水比例和洗脱体积对回收率的影响Fig.3 Effect of ammonia ratio and elution volume on the recovery rate in eluent

图4 不同体积分数的甲酸溶液所测得待测组分的色谱图Fig.4 Chromatograms of measured components in the sample by formic acid of different volume fraction

本实验选择梯度洗脱的方式，与等度洗脱相比，梯度洗脱降低了溶液中杂峰对泰妙菌素和沃尼妙林峰形的影响，避免造成分析误差，而且峰形尖锐，响应值高。泰妙菌素和沃尼妙林的分析时间为5 min，保留时间分别为1.95和2.03 min。

2.3 质谱条件的优化

由于泰妙菌素和沃尼妙林含有羰基、羟基和酰基等基团，故采用电喷雾离子源下正离子扫描(ESI+)模式。取200 μg·L－1的混合标准溶液，以 20 μL·min－1的流速注入离子源，在ESI(+)的模式下进行一级质谱全扫描，得到泰妙菌素和沃尼妙林的分子离子[M+H]+的m/z分别为494.08和565.46。调试确定毛细管电压为3.20 V，泰妙菌素的锥孔电压为30 V，沃尼妙林的锥孔电压为10 V。在加载电压和两者的锥孔电压不变的情况下，进行二级质谱扫描。通过改变碰撞能量，确定响应值最高的子离子为定量离子，响应值次高的子离子为定性离子。图5即为泰妙菌素和沃尼妙林的二级质谱图。

图5 泰妙菌素和沃尼妙林的二级质谱图Fig.5 Secondary mass spectrometry graph of tiamulin and valnemulin

2.4 线性范围检出限与定量限（标准曲线）

优化色谱条件、质谱条件和前处理条件后，配制成浓度分别为 0.1，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 ng·mL－1的混合标准工作液，在1.5节和1.6节的色谱质谱条件下进行测定，得到线性回归方程。实验结果表明，泰妙菌素和沃尼妙林的线性回归方程分别为

泰妙菌素和沃尼妙林在0.1～10.0 ng·mL－1内均具有良好的线性关系。以3倍信噪比为检出限，10倍信噪比为定量限，确定本方法泰妙菌素和沃尼妙林的检出限和定量限分别为0.03 和0.1 μg·kg－1。目前，我国出入境检验检疫行业标准SN/T 4483―2016《出口活鱼泰妙菌素检测技术规范》[28]中，泰妙菌素的检测限为 50 μg·kg－1，因此，本实验建立的方法能够满足国内检测的要求。

2.5 方法回收率和精密度

对草鱼、对虾和梭子蟹分别进行回收率实验，在每批次样品中分别加入 0.1，1.0，5.0，10.0 μg·kg-14种水平的混合标准工作液，并设置空白对照组，每个水平平行测定6次，共进行3批次实验，最终计算回收率和相对标准偏差。实验结果见表3，泰妙菌素和沃尼妙林的平均回收率为87%～114%，进一步证明样品前处理方法优化后降低了基质的干扰。实验的相对标准偏差为0.87%～6.50%，批间相对标准偏差为1.19%～9.96%，均小于10%。

2.6 实际样品验证

将 50条鲫鱼喂养在浓度为 0.5 μg·mL－1的泰妙菌素和沃尼妙林混合溶液中，连续药浴7 d。利用已建立的方法测定鲫鱼体内泰妙菌素和沃尼妙林的残留量，结果如表4所示。鲫鱼的各个组织中均能检测到泰妙菌素和沃尼妙林，其中，肾脏组织中泰妙菌素和沃尼妙林的总残留量最高，为453.81 μg·kg－1，肝脏次之，为 236.97 μg·kg－1。实验表明，本方法能用于日常泰妙菌素和沃尼妙林残留量的测定。

3 结论

本研究采用强阳离子固相萃取技术净化，选用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)检测，建立了一种能够检测水产品中泰妙菌素和沃尼妙林残留量的方法。方法采用乙腈提取1次，振荡超声后用MCX强阳离子交换柱净化，检测时间仅为5 min，高效准确。选用内标法定量分析泰妙菌素，外标法定量分析沃尼妙林，在空白草鱼、对虾和梭子蟹中分别加入 0.1，1.0，5.0 和 10.0 μg·kg－14个添加水平，2种抗生素药物的平均回收率为87%～114%，RSD小于10%。优化各项参数条件后，可降低基质效应，缩短前处理时间，且灵敏度较高，检出限和定量限分别为 0.03和 0.1 μg·kg－1，满足国内检测的相关要求，也为水产品中泰妙菌素和沃尼妙林残留量的检测提供了技术支持，可广泛应用于检测机构和水产企业的日常检验监测工作。