AFP阳性胃癌局部免疫状况的初步研究

杨 建 周业江

(西南医科大学附属医院胃肠外科，泸州646000)

胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，发病率与死亡率均较高，分别居所有恶性肿瘤的第2位及第3位[1]。近年来针对胃癌治疗方案的探索层出不穷，其中胃癌的免疫治疗是备受关注的热点之一。目前认为胃癌等诸多肿瘤的发生、发展与免疫耐受及抗肿瘤免疫水平的下调等有关。AFP+GC作为一种较为罕见的特殊类型胃癌，有研究表明其发病率约占所有胃癌患者的1.3%～15%，具有高度侵袭性、易发生肝脏及淋巴结转移、总体预后差等特点[2-5]。既然AFP+GC与AFP-GC在临床预后等特征上具有显著差异，那么AFP+GC与AFP-GC在局部免疫状况方面是否存在明显差异性值得进一步探讨。由于AFP+GC发病率低，现阶段与AFP+GC相关的研究以案例报告居多，而关于AFP+GC局部免疫状况的研究尚少见报道。本研究旨在探讨2013年12月～2017年12月于西南医科大学附属医院就诊并接受手术治疗的31例AFP+GC与65例AFP-GC患者在局部免疫状况上的差异性，以期从局部免疫状况方面进一步认识AFP+GC，进而为AFP+GC的临床个体化治疗提供更多的理论依据。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 研究对象 采用回顾性分析方法，查阅并收集西南医科大学附属医院胃肠外科2013年12月～2017年12月行胃癌根治术或姑息性切除手术治疗，且最终经病理确诊的原发性胃癌患者的完整病历资料。在排除肝硬化、肝炎、妊娠、生殖系胚胎源性肿瘤、原发性肝癌等可能引起AFP升高的疾患后，并按血清AFP>10 ng/ml，初步筛出AFP+GC患者32例，同时随机筛选出同期手术治疗的AFP-GC患者64例，共计96例。并于我院病理科调取相应患者的癌组织石蜡块，利用石蜡块通过免疫组化染色(S-P法)进一步划分AFP+GC与AFP-GC，最终得到AFP+GC患者31例，AFP-GC患者65例，共计96例。①在31例AFP+GC患者中：男18例，女13例；年龄45～74岁，≥60岁 17例，<60岁 14例；肿瘤大小：≥5 cm 18例，<5 cm 13例；组织分化良好(高/中分化腺癌)12例，差(低分化腺癌/未分化癌/黏液腺癌/印戒细胞癌)19例；浸润深度：T1/T2 8例，T3/T4 23例；淋巴结转移：有24例，无7例；肝转移：有15例，无16例；腹膜种植：有9例，无22例；TNM分期：Ⅰ/Ⅱ期 9例，Ⅲ/Ⅳ期 22例(按UICC/AJCC 2010版TNM分期划分)。②在65例AFP-GC患者中：男41例，女24例；年龄：43～77岁，≥60岁 38例，<60岁 27例；肿瘤大小：≥5 cm 26例，<5 cm 39例；组织分化：良好(高/中分化腺癌)30例，差(低分化腺癌/未分化癌/黏液腺癌/印戒细胞癌)35例；浸润深度：T1/T2 34例，T3/T4 31例；淋巴结转移：有36例，无29例；肝转移：有17例，无48例；腹膜种植：有7例，无58例；TNM分期：Ⅰ/Ⅱ期 36例，Ⅲ/Ⅳ期 29例(按UICC/AJCC 2010版TNM分期划分)。

1.1.2 实验材料 所有石蜡标本均连续切片，制成4 μm切片。鼠抗人S-100蛋白单克隆抗体、S-P检测试剂盒、DAB试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术公司；兔抗人FOXP3多克隆抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；兔抗人GZMB多克隆抗体购自美国Bioworld技术有限公司。均以PBS代替一抗作为阴性对照，使用试剂公司提供的阳性片作为阳性对照。

1.2 结果判定 S-100+DC的判定标准：以胞浆或胞核中出现棕黄色或淡黄色颗粒为阳性细胞，先在低倍镜(×100)选取癌细胞密集区，后更换高倍镜(×400)，计数6个高倍镜视野内浸润的总数，计数后取其平均值。

GZMB+CTL及GZMB+NK细胞的判定标准：以胞浆中出现棕黄色或淡黄色颗粒为阳性细胞，先在低倍镜(×100)选取癌细胞密集区，后更换高倍镜(×400)，计数6个高倍镜视野内浸润的GZMB+CTL及GZMB+NK细胞总数，计数后取其平均值。

Foxp3+Treg的判定标准：以胞核中出现黄色或棕黄色颗粒为阳性细胞，先在低倍镜(×100)选取癌细胞密集区，后更换高倍镜(×400)，计数6个高倍镜视野内浸润的Foxp3+Treg总数，计数后取其平均值。

2 结果

2.1 前期通过AFP抗体免疫组化染色对AFP+GC与AFP-GC的复筛结果 在胃癌组织中，AFP阳性颗粒定位于胞浆，图1A～D分别为AFP的阴性(-)、弱阳性(1+)、阳性(2+)、强阳性(3+)表达，本研究将“1+”、“2+”、“3+”视为阳性表达(即AFP+GC)。

2.2 AFP+GC与AFP-GC肿瘤微环境中的S-100+DC、Foxp3+Treg、GZMB+CTL和GZMB+NK细胞的浸润情况 AFP+GC肿瘤微环境中的S-100+DC、GZMB+CTL及GZMB+NK细胞数量显著少于AFP-GC，差异具有统计学意义(P<0.05)，AFP+GC肿瘤微环境中的Foxp3+Treg数量显著多于AFP-GC，差异具有统计学意义(P<0.05)，详见表1～3。图2E、F、G分别为肿瘤微环境中浸润的S-100+DC、Foxp3+Treg、GZMB+CTL和GZMB+NK细胞。

2.3 AFP+GC与AFP-GC肿瘤微环境中的S-100+DC、Foxp3+Treg、GZMB+CTL和GZMB+NK细胞浸润水平的分层分析 分层分析发现：①S-100+DC的浸润水平与淋巴结转移有关，仅在有淋巴结转移情况下AFP+GC肿瘤微环境中S-100+DC的浸润水平显著低于AFP-GC(P<0.05)；而无论肿瘤大小、分化程度、浸润深度、肝转移、腹膜种植、TNM分期如何，AFP+GC肿瘤微环境中S-100+DC的浸润水平均显著低于AFP-GC(P<0.05)。②Foxp3+Treg的浸润水平与病理分期有关，仅在Ⅲ/Ⅳ期组AFP+GC肿瘤微环境中Foxp3+Treg的浸润水平显著高于AFP-GC(P<0.05)；而无论肿瘤大小、分化程度、浸润深度、淋巴结转移、肝转移、腹膜种植如何，AFP+GC肿瘤微环境中Foxp3+Treg的浸润水平均显著低于AFP-GC(P<0.05)。③GZMB+CTL和GZMB+NK的浸润水平与分化程度、浸润深度、肝转移、腹膜种植有关，仅在分化差组、浸润深度达T3/T4组、无肝转移组、无腹膜种植组AFP+GC肿瘤微环境中GZMB+CTL和GZMB+NK的浸润水平显著低于AFP-GC(P<0.05)；而无论肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期如何，AFP+GC肿瘤微环境中GZMB+CTL和GZMB+NK的浸润水平均显著低于AFP-GC(P<0.05)。详见表4。

图1 胃癌组织中AFP的表达水平Fig.1 Expression level of AFP in gastric cancer tissuesNote: A.Negative expression of AFP;B.Weak positive expression of AFP;C.Positive expression of AFP;D.Strong positive expression of AFP.

图2 S-100+DC、Foxp3+Treg、GZMB+CTL和GZMB+NK细胞在肿瘤细胞中的浸润水平Fig.2 Infiltration levels of S-100+DC,Foxp3+Treg，GZMB+CTL and GZMB+NK cells in tumor microenvironmentNote: A.The S-100+DC in tumor imcroenvironment;B.The Foxp3+ Treg in tumor microvenvironment;C.The GZMB+CTL and GZMB+NK cells in tumor microenvironment.

表1 AFP+GC与AFP-GC肿瘤微环境中的S-100+DC浸润水平

Tab.1 Infiltration level of S-100+DC in tumor microenvironment of AFP+GC and AFP-GC

GroupsnS-100+DC(n/HPF,x±s)tPAFP+GC317.75±2.026.6290.0001)AFP-GC6511.46±3.43

Note：1)P<0.001.

表2 AFP+GC与AFP-GC肿瘤微环境中的GZMB+CTL及GZMB+NK细胞浸润水平

Tab.2 Infiltration level of GZMB+CTL and GZMB+NK cells in tumor microenvironment of AFP+GC and AFP-GC

GroupsnGZMB+CTL and GZMB+NK(n/HPF,x±s)tPAFP+GC313.24±1.353.4370.001AFP-GC654.36±1.55

表3 AFP+GC与AFP-GC肿瘤微环境中的Foxp3+Treg浸润水平

Tab.3 Infiltration level of Foxp3+Treg in tumor microenvironment of AFP+GC and AFP-GC

GroupsnFoxp3+Treg(n/HPF,x±s)tPAFP+GC3114.22±4.345.6780.0001)AFP-GC659.41±2.67

Note：1)P<0.001.

表4 AFP+GC与AFP-GC肿瘤微环境中局部免疫相关细胞浸润水平的分层分析

Tab.4 Stratified analysis of local immune-related cell infiltration levels in tumor microenvironment of AFP+GC and AFP-GC

ClinicopathologicfactorsAFP(+/-)nS-100+DCtPFoxp3+TregtPGZMB+CTLand GZMB+NKtPTumor size≥5 cmAFP+187.38±1.615.6830.0001)14.87±4.534.7980.0001)3.18±1.352.2390.030AFP-2612.04±3.709.07±2.914.19±1.56<5 cmAFP+138.27±2.462.8650.00613.31±4.063.0710.0083.33±1.412.3430.023AFP-3911.07±3.229.64±2.524.47±1.55Differential degreeHigh+ModerAFP+128.89±1.405.1080.0001)15.25±4.615.3270.0001)3.65±1.191.2180.230AFP-3012.57±3.279.20±2.684.26±1.56LowAFP+197.04±2.054.7450.0001)13.56±4.153.7710.0012.98±1.413.3940.001AFP-3510.51±3.329.58±2.704.44±1.55Depth of infiltrationT1/T2AFP+88.14±1.324.2870.0001)15.38±5.792.9350.0193.89±1.561.2260.227AFP-3411.49±3.669.19±2.944.60±1.47T3/T4AFP+237.62±2.224.8700.0001)13.81±3.794.6380.0001)3.02±1.232.6660.010AFP-3111.43±3.229.65±2.374.09±1.61Lymph node metastasisYesAFP+247.12±1.595.4910.0001)14.02±4.804.1820.0001)3.35±1.482.9300.005AFP-3610.70±3.409.58±2.494.48±1.45NoAFP+79.94±1.881.8980.06614.89±2.294.7890.0001)2.86±0.713.2780.003AFP-2912.40±3.289.20±2.924.20±1.67Liver metastasisYesAFP+157.05±2.202.0730.04715.21±4.223.8680.0013.42±1.651.3650.182AFP-178.75±2.4110.41±2.724.19±1.55NoAFP+168.42±1.646.4500.0001)13.29±4.373.6650.0023.08±1.023.2140.002AFP-4812.42±3.239.05±2.594.41±1.55Peritoneal implantationYesAFP+96.04±1.514.2610.00113.62±3.682.2260.0433.08±1.330.5980.559AFP-710.57±2.719.63±3.393.46±1.15NoAFP+228.45±1.795.2050.0001)14.46±4.644.8520.0003.31±1.383.0510.003AFP-5811.57±3.519.38±2.614.47±1.56TNM stageⅠ/ⅡAFP+98.52±1.724.8830.0001)12.23±4.851.8170.1012.83±1.252.7690.008AFP-3612.48±3.449.17±2.774.39±1.57Ⅲ/ⅣAFP+227.44±2.093.6680.00115.03±3.945.9750.0001)3.14±1.382.1580.036AFP-2910.20±3.029.38±2.564.31±1.54

Note：1)P<0.001.

3 讨论

目前国内外学者普遍认为，肿瘤的发生、发展与机体免疫系统的紊乱密切相关。机体免疫功能低下时，若不能及时发现、清除恶性突变的细胞，可导致恶性肿瘤的发生。在恶性肿瘤形成后癌细胞可刺激机体而诱发免疫应答，出现抗肿瘤免疫效应，以清除体内的恶性肿瘤细胞，但恶性肿瘤本身也可通过一系列机制抑制机体的抗肿瘤免疫效应或逃避免疫细胞的攻击。肿瘤与机体之间的相互作用结果，决定了肿瘤的转归。肿瘤微环境作为抗瘤免疫效应的第一战场，可以更直接地了解机体抗肿瘤免疫的强弱，在抗肿瘤免疫研究中具有重要作用，近年来各种肿瘤的局部免疫状态已经成为研究的热点之一。目前，国内外对胃癌的局部免疫状态的研究已不少，但对AFP+GC的局部免疫状态的研究尚缺乏。

DC是目前发现的效力最强的抗原提呈细胞(Antigen presenting cells，APC)，且髓系DC是唯一能够特异性启动初始T细胞介导的细胞免疫的APC[6，7]。目前已有众多的研究表明，肿瘤微环境中DC的水平与患者的预后密切相关，肿瘤微环境中DC的浸润水平越高，肿瘤患者的预后往往越好。此外，也有研究认为肿瘤患者的预后除与肿瘤微环境中的DC浸润水平有关外，还与DC的功能状态有关[8-12]。国外有研究者发现胃癌患者肿瘤微环境中的DC浸润水平与患者的淋巴结转移情况、生存时间有一定的关系，DC浸润水平越高，患者的生存时间越长[13-15]。除此之外，也有文献报道前列腺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结直肠癌中DC的浸润水平与患者的预后有关[12，16-19]。本研究结果表明，AFP+GC肿瘤微环境中的S-100+DC浸润水平低于AFP-GC，提示在AFP+GC中肿瘤浸润树突状细胞所表现出的正向免疫调节能力可能弱于AFP-GC，这可能是AFP+GC整体预后较AFP-GC差的免疫学原因之一。此外，本研究还发现肿瘤微环境S-100+DC浸润水平与淋巴结转移存在一定关系，但具体关系及可能的关联机制尚不清楚仍需进一步研究予以证实及阐明。

FOXP3是Treg的标志性分子，对中枢及外周淋巴器官中Treg的发育和功能具有重要作用[20]。Foxp3+Treg可通过产生TGF-β、IL-10、IL-35来抑制DC和效应T细胞，进而维持机体的免疫自稳，在食物抗原的口服耐受及共生菌的正常定植中具有重要作用[21]。随着研究的深入，发现Foxp3+Tregs的免疫抑制作用参与了肿瘤的免疫耐受，影响着肿瘤的免疫治疗及预后。本研究结果显示AFP+GC肿瘤微环境中的Foxp3+Treg浸润水平显著高于AFP-GC，提示AFP+GC可能较AFP-GC更易出现免疫耐受，这也可能是AFP+GC的预后较AFP-GC差的免疫学原因之一。此外，分层分析发现在分期较晚的胃癌患者中，AFP+GC较AFP-GC肿瘤微环境中的Foxp3+Treg浸润水平更高，但具体原因有待进一步研究予以阐明。

GZMB的表达是细胞毒细胞活化的标志，GZMB主要由CTL和NK细胞产生,也可由少数非淋巴细胞产生[22]。已有较多的研究表明，肿瘤微环境中浸润的CTL和NK细胞密度与抗肿瘤免疫强弱有关，CTL和NK细胞浸润水平越高，则患者的抗肿瘤免疫能力越强，预后可能越好[23-26]。本研究结果表明，AFP+GC肿瘤微环境中的GZMB+CTL及GZMB+NK细胞浸润水平低于AFP-GC，提示在AFP+GC中以CTL、NK细胞为代表的正向免疫调节能力可能弱于AFP-GC，这也可能是AFP+GC整体预后较AFP-GC差的免疫学原因之一。此外，分层分析发现在AFP+GC与AFP-GC间，肿瘤微环境中GZMB+CTL及GZMB+NK细胞的浸润水平还与分化程度、浸润深度等病理因素有一定关系，但具体关联机制尚不清楚。

本研究发现AFP+GC与AFP-GC在局部免疫状况方面存在明显的差异性，虽然导致此差异性的具体分子机制目前尚不清楚，但这一发现既可以从免疫学层面上对AFP+GC临床预后差的原因做出一定程度的解释，也为临床针对AFP+GC进行个体化治疗提供了免疫学理论依据。目前与DC有关的免疫治疗方案，如DC疫苗已经应用于临床，并已经在前列腺癌、黑色素瘤及结肠癌中取得了较好的疗效[27-29]，目前在胃癌、肾癌、肝细胞癌的临床试验中也初见成效[27，30-32]。而针对Treg的治疗主要包括[33]：①通过阻断免疫检查点而降低Treg的抑制功能；②抑制原位诱导Treg的产生；③阻止Treg向癌巢迁移。有文献报道针对Treg的治疗已经在肾细胞癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤中取得一定的疗效[34-37]。基于CTL的肿瘤免疫治疗方法已经在动物模型中取得了一定疗效[38]。因此，对AFP+GC的局部免疫状况进行探讨，可以从局部免疫状况层面进一步认识AFP+GC，并为AFP+GC患者的临床个体化治疗提供免疫学依据，以期改善AFP+GC患者的临床预后。