人钾离子通道调节蛋白的原核表达及纯化①

郭林红 周 炜

(北京大学第一医院风湿免疫科,北京100034)

人含有钾离子四聚化结构域蛋白(Potassium channel tetramerization domain-containing protein，KCTD)是一个包含25个成员的蛋白质家族，其中每个成员的N-末端都包含一个与钾离子通道四聚化T1结构域类似的结构域，但每个成员的C-末端序列不同，有着不同的生物功能[1]。目前该蛋白质家族的结构功能研究尚不深入，有文献报道，KCTD蛋白家族的一些成员可能参与癌症的发生或发展，如 KCTD9位于染色体8p22片段上，这个片段在肝癌、肺癌及其他许多癌症中常常缺失；KCTD10和KCTD12可能与胃肠道间质瘤有关[2]。

钾离子通道调节蛋白(Potassium channel regulator,KCNRG)是KCTD的家族成员之一，其基因位于染色体13q14.3片段上，包括3个外显子和2个剪接异构体，分别编码KCNRG-L(mRNA isoform NM-173605.1，272aa)和KCNRG-S(mRNA isoform NM-199464.2，229aa)两种亚型蛋白，它们的C端不同，具有184aa长度的共N端，其中四聚化T1结构域覆盖位置含7～98氨基酸[3,4]。慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤以及前列腺癌的发生可能与该基因的缺失、突变有关，同时KCNRG也可能是一个抑癌基因[3-5]。有文献报道KCNRG蛋白可以通过四聚化T1结构域形成多聚体，对电压门控钾离子通道hKv1.1和hKv1.4产生作用，减少钾离子内流[5]。KCNRG影响肿瘤生成的分子机制还不清楚，而明确KCNRG与其他蛋白的相互作用，是阐明其抑癌机制的关键。在基因组水平使用酵母双杂交技术筛查蛋白-蛋白相互作用的研究中，KCNRG可能与CCNK、FXR2、DGCR6L、AP5B1以及自身相互作用，其中一些蛋白-蛋白相互作用(如KCNRG与CCNK)可能与细胞增殖相关，但上述结果需要使用更多方法进一步验证[6]。

还有文献报道KCNRG蛋白主要分布在小气道上皮细胞，并在I型自身免疫性多内分泌腺病综合征(Autoimmune polyglandular syndrome type 1,APS-1)合并肺部疾病患者的血清中检测到了针对该蛋白的自身抗体，提示KCNRG可能是自身免疫性肺损伤的肺组织特异性抗原[7]。但是在另一篇文献中，APS-1合并肺部疾病的患者中并未检测到抗KCNRG抗体[8]。因此，KCNRG是否为自身免疫性肺病相关的自身抗原需要更多研究。在急性呼吸窘迫综合征和严重脓毒血症患者的血清中也同样检测到了该抗体，并与肺损伤和组织破坏程度相一致[9]。KCNRG自身抗体的产生是肺脏损伤的后果还是原因，需要在恰当模型中打破该蛋白的免疫耐受，对其相关免疫反应进行研究。

无论是对KCNRG进行蛋白-蛋白相互作用的研究，还是作为抗原进行相关疾病的血清学检测或免疫动物探讨打破免疫耐受的后果，均需要得到大量纯化的KCNRG重组蛋白。目前关于KCNRG蛋白的表达纯化还未见报道。本研究以pcDNA3.1-KCNRG-2ex质粒[3]为模板特异性扩增人KCNRG的编码区序列，并将该序列通过特异性双酶切插入原核表达载体pET28a-MBP-His和pGEX-4T-1中，构建pET28a-KCNRG-MBP-His和pGEX-4T-1-KCNRG载体，最终探讨和优化KCNRG融合蛋白体外诱导表达的流程，为KCNRG的高效表达和纯化提供方法与经验。表达的KCNRG蛋白可用于研究蛋白间相互作用、肿瘤发生的分子机制，也可以作为抗原免疫动物建立动物模型，为进一步研究KCNRG蛋白产生免疫反应的相关疾病机制奠定良好的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒与菌株 质粒：pET28a-MBP-His和pGEX-4T-1载体由中国农业大学赵要风教授馈赠，pcDNA3.1-KCNRG-2ex载体由Mikhail Skoblov教授馈赠[3]。菌株：大肠杆菌Rosetta(DE3)购于TIANGEN公司；TOP10为本实验室保存菌种。

1.1.2 试剂 PCR MasterMix、DNA Marker、琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒购于Tiangen公司；XhoⅠ和NdeⅠ限制性内切酶购于Thermo公司；异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)购于上海生物工程有限公司；溶菌酶、PMSF、小鼠抗6×His单克隆抗体购于上海生物工程有限公司；小鼠抗GST单克隆抗体购于Santa公司；Ni-NTA Agarose购于Qiagen公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 根据pcDNA3.1-KCNRG-2ex质粒扩增KCNRG目的基因(NM-173605.1)，设计引物，引入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点以克隆入pET28a-MBP-His载体，引入BamHⅠ、NotⅠ酶切位点以克隆入pGEX-4T-1载体。KCNRG-F1：GCACATATGATGAGTAGTCAGGAACTGGTCACTTTG;KCNRG-R1：GC-ACTCGAGTCATTTCTTTATCTGAGATTGCTCTGG;KCNRG-F2：GCAGGATCCATGAGTAGTCAGG-AACTGGTC;KCNRG-R2：GCAGCGGCCGCTCATTT-CTTTATCTGA-GATTGCTCT。

1.2.2 KCNRG目的基因的扩增 以pcDNA3.1-KCNRG-2ex质粒为模板进行PCR反应，反应条件为：92℃ 3 min；92℃ 30 s；55℃ 30 s；72℃ 1 min，35个循环；72℃ 5 min，PCR产物4℃保存。取2 μl PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳。

1.2.3 pET28a-KCNRG-MBP-His和pGEX-4T-1-KCNRG重组表达质粒的构建 用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒切胶回收PCR产物，参照说明书进行具体操作。用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切pET28a-MBP-His、BamHⅠ和NotⅠ双酶切pGEX-4T-1及PCR回收产物，37℃水浴条件下酶切5 h。将酶切后的产物再次用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行纯化回收。按照目的基因与载体物质的量比3∶1，用T4 DNA连接酶将双酶切的KCNRG基因连接在原核表达载体pET28a-MBP-His和pGEX-4T-1上，22℃水浴条件下连接2 h。将连接产物分别转化TOP10感受态细菌中，分别涂布于含有卡那霉素(Kan)和氨苄青霉素(Amp)的LB平板，37℃培养箱中倒置培养16 h。挑取长势良好的单克隆菌落的一半为模板进行PCR，对克隆的KCNRG目的基因进行鉴定。挑取菌落PCR阳性的菌落分别接种在含Kan抗性和Amp抗性的LB培养液中，37℃振荡培养过夜。使用质粒小量提取试剂盒按照说明书提取单克隆菌液中的质粒，分别通过内切酶NdeⅠ、XhoⅠ和BamHⅠ、NotⅠ双酶切验证阳性克隆。将双酶切产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行分析。将鉴定成功的重组质粒送北京美吉桑格生物医药科技有限公司测序。测序结果经BLAST比对分析，比对序列和人的KCNRG CDS区序列完全相同，并命名质粒为pET28a-KCNRG-MBP-His和pGEX-4T-1-KCNRG。

1.2.4 KCNRG基因在pET28a-KCNRG-MBP-His和pGEX-4T-1-KCNRG载体中的原核表达 将提取的重组质粒pET28a-KCNRG-MBP-His和pGEX-4T-1-KCNRG分别转化到Rosetta(DE3)感受态细胞中，挑取单克隆菌落分别接种于含Kan抗性和Amp抗性的LB培养液中，37℃振荡培养过夜。取过夜的菌液按照1∶100的浓度分别接种含Kan和Amp的LB培养液中，37℃振荡培养至OD600为0.4～0.6。诱导前取1 ml菌液，存于4℃。加入终浓度为1.0 mmol/L 的IPTG进行诱导融合蛋白表达。诱导后4 h取1 ml菌液，5 000 r/min离心5 min后弃上清，分别加入100 μl PBS重悬，加入终浓度为1 mg/ml 的溶菌酶混匀，冰上放置15 min后加入终浓度为1.0 mmol/L的PMSF混匀。液氮反复冻融7、8次后，4℃ 12 000 r/min离心15 min，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色，对融合蛋白KCNRG的表达进行鉴定。

1.2.5 鉴定KCNRG融合蛋白 将上述诱导样品进行SDS-PAGE电泳，湿转至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，加入一抗(1∶2 000)小鼠抗6×His单克隆抗体及一抗(1∶200)小鼠抗GST单克隆抗体，4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，10 min/次，再加入二抗(1∶5 000)HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体，室温孵育1 h，TBST洗膜2次，10 min/次，TBS洗膜10 min，ECL发光、照相。

1.2.6 亲和层析纯化融合蛋白KCNRG 将甘油菌pET28a-KCNRG-MBP-His复苏，于37℃振荡培养过夜，次日按照1∶100的浓度接种于含抗生素Kan的250 ml LB培养液中，37℃振荡培养0.4～0.6 h，经过优化组合，加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG，37℃诱导融合蛋白表达4 h。将所有菌液5 000 r/min 离心5 min弃上清，加入3 ml的binding/wash buffer 重悬菌体，加入终浓度为1 mg/ml 的溶菌酶混匀，冰上放置15 min 后加入终浓度为1.0 mmol/L的PMSF混匀。液氮反复冻融5～6次后，按照功率300 W，超5 s，停 5 s，冰上超声破碎10～15 min。4℃、12 000 r/min离心15 min，收取上清。上清用0.22 μm膜过滤。通过Ni2+亲和层析柱纯化样品，以10 mmol/L咪唑缓冲液洗脱杂蛋白，250 mmol/L咪唑缓冲液洗脱目的蛋白。用SDS-PAGE检测纯化的蛋白，并测定蛋白纯度和浓度。

2 结果

2.1 PCR扩增产物电泳鉴定结果 PCR产物经1%琼脂糖电泳，结果如图1(A：用含有内切酶NdeⅠ、XhoⅠ的特异引物扩增；B：用含有内切酶BamHⅠ、NotⅠ的特异引物扩增)所示。使用设计的引物以pcDNA3.1-KCNRG-2ex质粒为模板，成功扩增出了特异性目的条带，其大小与预计的819 bp相一致。

2.2 重组质粒的鉴定结果 使用KCNRG的PCR引物进行菌落PCR鉴定，从图2可以看出，PCR产物与目的基因KCNRG长度相一致的明显条带。图3中，pET28a-KCNRG-MBP-His重组质粒用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ双酶切的产物分别约为819 bp、6.4 kb两个条带(A)。pGEX-4T-1-KCNRG重组质粒用限制性内切酶BamHⅠ、NotⅠ双酶切的产物分别约为819 bp、4.9 kb两个条带(B)。初步证明重组质粒含有目的基因。

2.3 重组质粒表达产物分析 用重组质粒pET28a-KCNRG-MBP-His和pGEX-4T-1-KCNRG转染Rosetta(DE3)感受态细胞。用1.0 mmol/L IPTG诱导重组菌。KCNRG目的基因为819 bp，大小约30 kD，pET28a-MBP-His载体上的融合蛋白MBP大小约为42 kD，故KCNRG-MBP融合蛋白大小应在72 kD左右，从图4A可以看出，在70～100 kD之间，泳道2和泳道4有明显目标条带出现，说明目标蛋白在上清和沉淀中均有表达；pGEX-4T-1-KCNRG载体上的融合蛋白GST大小约26 kD，故GST-KCNRG融合蛋白大小应在56 kD左右，从图4B。可以看出，在55～70 kD之间，泳道4有明显目标条带出现，说明目标蛋白主要在沉淀中表达。

图1 PCR扩增KCNRG基因Fig.1 PCR amplification of KCNRGNote: M.D2000 DNA marker；1.PCR amplification of KCNRG.

2.4 重组蛋白的Western blot鉴定 将蛋白粗提物进行SDS-PAGE电泳后， 转PVDF膜， 进行Westernblot鉴定。结果显示，图5A中无论上清还是沉淀，PVDF膜上在72 kD大小处有一明显条带产生；图5B中只有沉淀中，PVDF膜上在56 kD大小处有一明显条带产生。与融合蛋白的大小一致，证明KCNRG融合蛋白成功表达。

图2 重组质粒pET28a-KCNRG-MBP-His和pGEX-4T-1-KCNRG的菌落鉴定结果Fig.2 Identification of recombinant plasmids pET28a-KCNRG-MBP-His and pGEX-4T-1-KCNRG with colony PCRNote: M.D2000 DNA marker；1-4.PCR product of the colony.

图3 双酶切验证重组质粒pET28a-KCNRG-MBP-His和pGEX-4T-1-KCNRGFig.3 Identification of recombinant plasmids pET28a-KCNRG-MBP-His and pGEX-4T-1-KCNRG with restriction enzyme digestionNote: A.M1.D2000 DNA marker；1.pET28a-KCNRG-MBP-His was digested by NdeⅠ and XhoⅠ enzymes；M2.D15000+2000 DNA marker;B.M1.D2000 DNA marker；1.pGEX-4T-1-KCNRG was digested by BamHⅠ and NotⅠ enzymes；M2.D15000+2000 DNA marker.

2.5 KCNRG融合蛋白纯化SDS-PAGE电泳图 经过不同温度和不同IPTG诱导浓度组合，以IPTG终浓度0.1 mmol/L，37℃诱导4 h扩大培养。图6中在70～100 kD处有明显单一的目的条带，通过凝胶成像系统软件分析纯化蛋白的纯度>90%，BCA法测定蛋白浓度，250 ml菌液收集融合蛋白KCNRG约为5.7 mg，说明获得了较好纯度和浓度的目的蛋白。

图4 SDS-PAGE检测KCNRG的表达Fig.4 Detection of KCNRG expression by SDS-PAGNote: A.M.10-180 kD marker； 1.Supernatant of pET28a-KCNRG-MBP-His bacteria without induction；2.Supernatant of induced pET28a-KCNRG-MBP-His bacteria；3.Deposition of pET28a-KCNRG-MBP-His bacteria without induction；4.Deposition of induced pET28a-KCNRG-MBP-His bacteria;B.M.10-180 kD marker；1.Supernatant of induced pGEX-4T-1 bacteria；2.Supernatant of induced pGEX-4T-1-KCNRG bacteria；3.Deposition of induced pGEX-4T-1 bacteria；4.Deposition of induced pGEX-4T-1-KCNRG bacteria.

图5 用抗6×His单抗(A)和抗GST单抗(B)检测KCNRG融合蛋白Fig.5 Detection of KCNRG fusion protein by Western blot using anti-6×His antibody(A)and anti-GST antibody(B)Note: A.M.10-180 kD marker；1.Deposition of induced pET28a-KCNRG-MBP-His bacteria；2.Supernatant of induced pET28a-KCNRG-MBP-His bacteria;B.M.10-180 kD marker；1.Deposi-tion of induced pGEX-4T-1-KCNRG bacteria；2.Supernatant of induced pGEX-4T-1-KCNRG bacteria.

图6 SDS-PAGE分析纯化的KCNRG融合蛋白Fig.6 Analysis of purified KCNRG fusion protein by SDS-PAGENote: M.10-180 kD maker；1.Purified KCNRG fusion protein.

3 讨论

大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早和目前应用最广的经典表达系统[10]。其具有遗传背景清楚、培养操作简单、生长繁殖快、成本低、产量高、表达产物纯化过程简单、产物稳定性好、不易污染等优点，得到了广泛应用，并取得了巨大的科研价值和经济效益[11-13]。目前在科研和工业上被广泛应用的大肠杆菌表达载体主要有pGE系列、pQE系列和pET系列，其中被广泛应用的高效表达载体是pET[11]。pET表达载体中，目标基因被克隆到PET表达载体上，受T7噬菌体强转录和翻译信号控制，并通过宿主细胞提供T7 RNA聚合酶来诱导表达，但不足之处在于多数是以包涵体的形式存在[10]。融合表达载体是将融合蛋白基因与外源基因结合，利用融合信号肽将融合蛋白分泌到细胞周质或胞外表达，有利于形成二硫键以及避免胞质蛋白酶的水解，并有利于目的蛋白的分离和纯化，其包括谷胱甘肽转移酶(GST)系统、麦芽糖结合蛋白(MBP)系统、纯化标签融合系统等[11,14]。GST的分子量约为26 kD，作为一种分子伴侣可以高效促进蛋白质完成正确折叠，形成有功能的区域、增强蛋白的可溶性和帮助重组蛋白免受蛋白酶的水解，稳定融合蛋白的结构[15]。MBP的分子量大小约为42 kD，是目前应用范围最广泛的促使外源蛋白可溶性表达的分子伴侣，可提高与其融合的蛋白质或多肽的可溶性，有利于形成二级结构，保持目的蛋白的良好抗原性[10,15,16]。作为外源基因的表达宿主，BL12(DE3)添加了T7聚合酶基因，是为T7表达系统而设计的[17,18]。Rosetta(DE3)来源于BL-21(DE3)，其含有pRARE质粒，能够提供含有AGG、AGA、AUA、CUA、CCC和GGA稀有密码子的tRNA，从而大大提高了目的蛋白的表达量[19,20]。

本实验起初选择了pGEX-4T-1表达载体，经过多种组合，目的蛋白未能在上清中大量表达，主要以包涵体形式存在。换用pET28a-MBP-His融合表达载体后，诱导温度在37℃条件下，就可以获得大量的可溶性目的蛋白，也进一步证实了MBP系统的水溶性较大，可以提高与其融合的蛋白质的可溶性。本研究使用pET28a载体表达KCNRG-MBP融合蛋白，在Rosetta(DE3)菌株中，可以高效生产高纯度重组蛋白。得到的重组蛋白为后续进行蛋白质体外结合实验验证蛋白-蛋白相互作用、质谱分析深入研究KCNRG的作用机制及蛋白间的相互作用提供了有力工具，为深入认识KCNRG对于癌症的调控机制奠定了基础。重组KCNRG可以作为抗原，使用ELISA或免疫印迹等方法对相关疾病患者血清进行检测，明确抗KCNRG与自身免疫性肺部疾病发生发展的关系。得到的重组蛋白还可以作为抗原免疫小鼠，如果其免疫小鼠能够造成肺部病变，证实它是与自身免疫病相关的肺组织特异自身抗原，建立的动物模型将成为研究自身免疫病相关肺部病变发病机制的重要手段。