缺氧诱导因子-1α与非特殊型浸润性乳腺癌分子分型及血管生成的关系分析①

黄玉钿 郑 曦 吴钦穗 薛玉钦 吴 进

(福建医科大学附属福州市第一医院病理科，福州350009)

乳腺癌是我国常见的女性恶性肿瘤，发病率有逐年升高的趋势。非特殊型浸润性乳腺癌(Invasive breast carcinoma of no specific type，IBC-NST)是最常见的浸润性乳腺癌组织类型，占浸润性乳腺癌的40%～75%，具有高度异质性，多种因素影响其恶性程度和患者预后。研究表明，乳腺癌的分子分型(Luminal A型、Luminal B型、HER2过表达型和三阴性型)与乳腺癌生物学行为和疗效密切相关，已广泛应用于指导IBC-NST的临床治疗和预后判断[1]。人类表皮生长因子受体2(Human epidermal growth factor receptor,HER2)基因靶向治疗或抗雌激素治疗是针对HER2阳性或激素受体阳性的乳腺癌所提供的抗癌方案，却不适用于三阴性型乳腺癌，寻求其他有效治疗靶点对乳腺癌临床治疗具有重要意义。

在乳腺癌组织中，随着癌细胞不断增殖导致耗氧量增加，使得缺氧成为乳腺癌组织微环境中的普遍现象。研究表明，缺氧诱导因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)在恶性肿瘤细胞适应缺氧环境、肿瘤免疫逃逸及维持增殖活性等过程中发挥重要作用[2]。HIF-1α能否促进乳腺癌血管生成以及HIF-1α表达与乳腺癌分子分型的关系尚未明确。我们通过研究IBC-NST中HIF-1α表达与分子分型、血管生成、病理分级及TNM分期等之间的关系，探讨HIF-1α在乳腺癌发生发展过程中的作用及其意义。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 一般资料 收集2010～2015年在福建医科大学附属福州市第一医院行改良根治切除的非特殊型浸润性乳腺癌150例，均为女性患者，年龄34～75岁，中位年龄51岁，术前未接受抗乳腺癌治疗，并以30例乳腺癌旁正常乳腺组织作为对照，所有病例均有完整的临床和病理资料，以具有代表性的石蜡包埋组织作为检测对象。乳腺癌分子分型依据2013年St Gallen国际乳腺癌会议共识[3]，采用免疫组化(Immunohistochemistry，IHC)替代分型，分为：Luminal A型，为HER2阴性，雌激素受体(Estrogen receptor,ER)阳性，孕激素受体(Progesterone receptor，PR)表达指数≥20%且Ki67表达指数<20%；Luminal B型有2种，其一为HER2阴性，ER阳性，PR表达指数<20%或Ki67表达指数≥20%，另一为HER2阳性，ER阳性，PR和Ki67表达指数任意；HER2过表达型，为HER2阳性，ER和PR均阴性；三阴性型为HER2、ER和PR均阴性。IBC-NST病理分级按照Elston & Ellis法[4]，根据腺管形成比例、细胞核多形性及核分裂数3项得分之和，分为1～3三个级别，分级越高反映肿瘤分化程度越差、恶性度越高。乳腺癌分期采用TNM分期法(AJCC/UICC第7版)，根据肿瘤大小、淋巴结转移及远处转移情况将浸润性乳腺癌分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期。

1.1.2 试剂 EliVision免疫组化试剂盒购自福州迈新生物公司。一抗试剂如下：鼠抗人HIF-1α单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，兔抗人HER2单克隆抗体购自瑞士Roche公司，兔抗人ER、PR单克隆抗体和鼠抗人Ki67、CD34单克隆抗体购自美国Thermo Fisher公司。PathVysion HER2/CEP17 DNA双色荧光探针试剂盒购买Abbott Molecular公司。

1.2 方法

1.2.1 IHC EliVision免疫组化检测二步法主要步骤如下：乳腺癌组织经4%中性甲醛固定、石蜡包埋组织以3～4 μm厚度切片并贴于防脱玻片，经脱蜡、水化及抗原修复后，以3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，滴加一抗，室温孵育60 min，滴加聚合物增强剂，室温孵育20 min，滴加酶标抗鼠/兔聚合物，室温孵育30 min，再经DAB显色，苏木精衬染，脱水干燥及封片后置于普通光学显微镜下观察。另检测正常乳腺组织HIF-1α、CD34的免疫组化表达情况作为对照。各项指标检测过程中均以已知阳性片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。HIF-1α结果判定采用半定量法：将定位于IBC-NST细胞核的染色按深浅评分，无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；再对整张切片中着色IBC-NST细胞占IBC-NST细胞总数的比例评分，着色细胞<5%为0分，着色细胞≥5%且<10%为1分，着色细胞≥10%且<50%为2分，着色细胞≥50%为3分；两项得分乘积≥4为HIF-1α阳性表达；正常对照组乳腺细胞核HIF-1α表达情况参照此法判读。IBC-NST组织HER2免疫组化结果判读根据2018年ASCO/CAP发布的检测指南[5]，将3+(10%以上浸润性癌细胞呈强且完整的细胞膜染色)定义为HER2阳性；2+(10%以上浸润性癌细胞呈弱到中等强度的完整细胞膜染色)为结果不确定，需进一步荧光原位杂交法(Fluorescence in situ hybridization,FISH)检测HER2基因扩增情况后再判定阳性或阴性；1+及0则定义为HER2阴性。ER和PR表达结果的判读根据2010年ASCO/CAP发布的乳腺癌ER、PR免疫组化检测指南[6]，评估整张切片中ER或PR阳性的IBC-NST细胞数占IBC-NST细胞总数的百分比，当≥1%的IBC-NST细胞核呈现不同程度的ER或PR着色时，即为ER或PR阳性。Ki67结果判读方法参照2011年国际乳腺癌Ki67工作组共识[7]：选取切片中IBC-NST细胞核Ki67表达率高的热点区，于高倍视野下评估Ki67阳性的IBC-NST细胞数占IBC-NST细胞总数的百分比，观察3个以上高倍视野(计数500个以上IBC-NST细胞)，取平均值作为Ki67表达指数。CD34结果判读参照Weidner标准[8]：IBC-NST组织内CD34细胞浆着色的单个血管内皮细胞或细胞簇，不论是否形成管腔，均代表1个微血管，但管径大于8个红细胞直径的血管不作为计数，选择5个富于微血管的热点区，在200倍视野下计数每个视野中的微血管数量，取平均值作为微血管密度(Microvessel density，MVD)；正常对照组MVD参照此法判读。

1.2.2 FISH HER2 IHC 2+的IBC-NST组织进一步通过FISH检测HER2基因扩增情况，采用DNA双色荧光探针试剂盒进行检测。主要步骤如下：经4%中性甲醛固定、石蜡包埋的乳腺癌组织按3～4 μm 厚度切片，贴于涂胶玻片上，切片经脱蜡、漂洗、固定、脱水、自然干燥后，取10 μl探针工作液滴加于组织切片上，橡胶水泥封边，将玻片置于原位杂交仪中，78℃变性5 min后，42℃杂交12～18 h，杂交后经洗涤、干燥、再滴加10 μl的4′,6-二脒基-2-苯基吲哚，通过荧光显微镜观察检测结果(橘红色荧光标记HER2，绿色荧光标记CEP17)后于-20℃冰箱中避光保存。HER2 IHC 2+的IBC-NST组织的HER2 FISH结果判读根据2018年ASCO/CAP指南[5]：复查确定HER2 IHC结果为2+，对同一组织进行FISH检测后，在IHC 2+的浸润性癌区域计数至少20个浸润性癌细胞的FISH荧光信号，将HER2/CEP17≥2．0且HER2拷贝数/细胞≥4．0，或HER2/CEP17<2．0但HER2拷贝数/细胞≥6．0判定为HER2基因扩增(HER2阳性)；将HER2/CEP17≥2．0且HER2拷贝数/细胞<4．0，或HER2/CEP17<2．0且HER2拷贝数/细胞<6．0判定为HER2基因无扩增(HER2阴性)。

2 结果

2.1 HIF-1α和MVD在IBC-NST和正常乳腺组织中的表达差异 HIF-1α免疫组化阳性表达于乳腺癌细胞核(图1A)，HIF-1α在IBC-NST中的表达阳性率高于正常对照组的阳性率，差异具有统计学意义(P<0.05)。CD34免疫组化阳性表达于乳腺癌间质血管内皮细胞浆(图1B)，CD34标记的IBC-NST间质MVD高于正常对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2 HIF-1α表达与IBC-NST年龄、病理分级及TNM分期的关系 HIF-1α在不同年龄、病理分级的IBC-NST分组中阳性表达的差异无统计学意义(P>0.05)。HIF-1α在TNM Ⅲ～Ⅳ期IBC-NST中的表达阳性率为71.9%，高于TNM Ⅰ～Ⅱ期IBC-NST中的53.5%，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.3 HIF-1α表达与IBC-NST分子分型的关系 HIF-1α在Luminal A型、Luminal B型、HER2过表达型和三阴性型IBC-NST中的表达阳性率分别为28.1%(9/32)、56.4%(31/55)、85.3%(29/34)和79.3%(23/29)。HER2过表达型或三阴性型IBC-NST中的HIF-1α表达阳性率均高于Luminal A型或Luminal B型，差异具有统计学意义(P<0.05)，Luminal B型IBC-NST中HIF-1α表达阳性率高于Luminal A型(P<0.05)，而HER2过表达型和三阴性型间的HIF-1α表达阳性率差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

2.4 IBC-NST中HIF-1α表达与HER2、ER、PR及Ki67表达的关系 IHC检测HER2阳性(3+)的乳腺癌显示10%以上浸润性癌细胞呈强且完整的细胞膜染色(图1C)，HER2 IHC 2+的IBC-NST经FISH检测有HER2基因扩增者(图3)也为HER2阳性。ER、PR和Ki67免疫组化阳性均表达于IBC-NST细胞核(图1D、E和F)。HIF-1α阳性组IBC-NST的HER2阳性率与HIF-1α阴性组IBC-NST的HER2阳性率相比，两组间差异无统计学意义(P>0.05)。HIF-1α阳性组IBC-NST的ER和PR阳性率均低于HIF-1α阴性组，差异均具有统计学意义(P<0.05)。HIF-1α阳性组IBC-NST的Ki67表达指数高于HIF-1α阴性组，差异具有统计学意义(P<0.05),见表3。

图1 免疫组化检测IBC-NST中HIF-1α、CD34、HER2、ER、PR和Ki67的阳性表达Fig.1 Positive expression of HIF-1α,CD34,HER2,ER,PR and Ki67 in IBC-NST by immunohistochemistryNote: A.HIF-1α;B.CD34;C.HER2;D.ER;E.PR;F.Ki67.

表1 HIF-1α和MVD在IBC-NST和正常乳腺组织中的表达差异

Tab.1 Differential expression of HIF-1α and MVD between IBC-NST and normal breast tissues

GroupsnHIF-1α positiveMVDNormal breast302(6.7%)12.43±4.06IBC-NST15092(61.3%)1)28.37±7.831)

Note：Compared with normal breast，1)P<0.05.

表2 HIF-1α表达与IBC-NST年龄、病理分级及TNM分期的关系

Tab.2 Relationship between HIF-1α expression and age,pathologic grade and TNM stage of IBC-NST

GroupsnHIF-1α positivePAge<507247(65.3%)≥507845(57.7%)>0.05Pathologic grades13419(55.9%)24927(55.1%)36746(68.7%)>0.05TNM stagesⅠ-Ⅱ8646(53.5%)Ⅲ-Ⅳ6446(71.9%)<0.05

2.5 IBC-NST中HIF-1α表达与MVD的关系 HIF-1α阳性组(92例)IBC-NST的MVD高于HIF-1α阴性组(58例)IBC-NST，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图4。

图2 HIF-1α表达与IBC-NST分子分型的关系Fig.2 Relationship between HIF-1α expression and molecular subtype of IBC-NSTNote: Compared with Luminal A，*.P<0.05；compared with Luminal A or B，#.P<0.05.

图3 荧光原位杂交检测IBC-NST中HER2基因的扩增Fig.3 Amplification of HER2 gene in IBC-NST by fluorescence in situ hybridization

表3 IBC-NST中HIF-1α表达与HER2、ER、PR和Ki67表达的关系

Tab.3 Relationship between HIF-1α expression and HER2,ER,PR and Ki67 expression in IBC-NST

GroupsnHER2positiveERpositivePRpositiveKi67index(%)HIF-1α positive9238(41.3%)45(48.9%)43(46.7%)27.86±8.01HIF-1α negative5821(36.2%)42(72.4%)1)41(70.7%)1)19.03±5.491)

Note：Compared with positive group，1)P<0.05.

图4 IBC-NST中HIF-1α表达与MVD的关系Fig.4 Relationship between HIF-1α expression and MVD in IBC-NSTNote: Compared with negative group，*.P<0.05.

3 讨论

缺氧是恶性肿瘤的一个重要特征，肿瘤细胞的高生长活性是造成肿瘤微环境相对缺氧的主要因素。HIF-1α基因位于人染色体14q21～24，编码826个氨基酸，对缺氧极为敏感，是HIF-1所特有的一种氧调节亚单位[9]。在常氧状态下HIF-1α很难检测到，而在缺氧条件下HIF-1α表达活性增强，并转移到细胞核内与HIF-1β亚单位结合形成有活性的HIF-1二聚体，再结合到靶基因的启动子或增强子的缺氧反应元件上，从而激活多种基因的转录表达，产生对缺氧的适应，维持恶性肿瘤的生长活性，在多种恶性肿瘤中检测到HIF-1α呈高表达，而在相应的正常组织或良性肿瘤中不表达或低表达[10]。

本研究为排除特殊型浸润性乳腺癌一些特殊的生物学行为、分级标准及预后因素对数据分析结果的影响，选择IBC-NST作为研究对象。研究结果显示IBC-NST中HIF-1α的表达阳性率较正常对照组显著增高，表明HIF-1α的高表达是乳腺癌发生发展过程中一个重要的分子事件，Aghazadeh等[11]研究表明，HIF-1α高表达能抑制STAT3活性从而下调抑癌基因PTEN的转录水平，而PTEN的低表达提高了乳腺癌细胞在缺氧环境中的增殖活性，促进乳腺癌的进展。本研究显示随着乳腺癌TNM分期升级，HIF-1α表达阳性率显著增高，提示HIF-1α能促进乳腺癌增殖转移，导致分期升级，是代表预后不良的一项指标。但本研究中不同病理分级IBC-NST组间HIF-1α表达无显著差异，不影响乳腺癌分化程度，与Sharma等[12]研究一致，提示HIF-1α促进乳腺癌发展的机制与调控癌细胞分化无密切关系，而存在其他促癌机制。

有关HIF-1α与乳腺癌分子分型的研究鲜见报道，Yehia等[13]研究结果显示乳腺癌不同分子分型中HIF-1α蛋白表达差异无统计学意义；而本研究结果显示HER2过表达型或三阴性型IBC-NST中的HIF-1α表达均显著高于Luminal A型或B型，提示激素受体阴性的前两型乳腺癌中HIF-1α表达水平高于激素受体阳性的后两型乳腺癌，且本研究中HIF-1α阳性组ER、PR低表达的结果也证明了这一现象。Padró等[14]研究结果与本研究一致，并且认为HIF-1α是通过诱导泛素连接酶间接增强ER、PR的水解以拮抗ER、PR活性，而非直接抑制其转录，因此HIF-1α的高表达也提示乳腺癌抗雌激素治疗效果不理想。本研究中HER2过表达型和三阴性型IBC-NST间HIF-1α的表达无显著差异，且HER2在HIF-1α阳性与阴性组间表达也无显著差异，均提示HER2对HIF-1α的表达无调控作用。三阴性型和HER2过表达型乳腺癌都不适用抗雌激素治疗，而且三阴性型相对HER2过表达型而言，尚缺少有效的基因治疗靶点。HIF-1α的高表达提示其可为激素受体阴性乳腺癌，尤其是三阴性型乳腺癌的治疗提供更多的选择，而对于HER2过表达型乳腺癌联合HER2和HIF-1α两种靶向治疗也有望进一步提高疗效。Xiang等[15]研究显示，热休克蛋白90的第二代抑制剂Ganetespib能显著下调HIF-1α的mRNA和蛋白表达，降低多个下游基因活性，有效抑制乳腺癌的侵袭转移，显示HIF-1α在基因靶向治疗方面具有重要的潜在价值。

本研究显示HIF-1α阳性组Ki67增殖指数显著高于HIF-1α阴性组，表明HIF-1α具有调控乳腺癌细胞生长周期、促进乳腺癌增殖能力的作用，提示抑制乳腺癌HIF-1α的表达能有效降低乳腺癌的增殖活性，提高疗效。Sato-Tadano等[16]研究也表明HIF-1α能通过诱导己糖激酶Ⅱ增强乳腺癌细胞糖酵解活性，调控细胞代谢及生长周期，进而提高乳腺癌细胞Ki67增殖指数。本研究还显示Luminal B型IBC-NST的HIF-1α表达显著高于Luminal A型。Luminal A和B型乳腺癌除了具有激素受体阳性的共同点外，Ki67指数是区分两者的重要条件之一，Luminal A型有一个必备条件是Ki67指数<20%，而Luminal B型则包含相当数量Ki67指数≥20%的乳腺癌，提示Luminal B型乳腺癌HIF-1α高表达可能是此型乳腺癌中部分病例Ki67高表达的因素之一，而HIF-1α能否作为区分Luminal A和B型乳腺癌的一个参考指标，其意义及表达指数截断值有待进一步研究。

肿瘤间质微血管生成是肿瘤细胞获得营养并赖以生存、增殖的最基本条件之一。在多种恶性肿瘤中，微血管生成水平高于正常组织，且与肿瘤恶性程度密切相关[17,18]。本研究结果显示，IBC-NST的MVD显著高于正常对照组，表明微血管生成在乳腺癌发生发展过程中扮演重要角色。本研究还显示，HIF-1α阳性组IBC-NST的MVD显著高于HIF-1α阴性组，表明HIF-1α具有促进乳腺癌血管生成的作用。HIF-1α的促血管生成作用是通过HIF-1α/VEGF通路，上调肿瘤细胞VEGF转录合成水平，促进间质血管内皮细胞生长及微血管的形成[19,20]。此外，HIF-1α可通过上调VEGF的表达以阻碍肿瘤微环境中树突状细胞的成熟，削弱其抗原呈递作用[21]；HIF-1α还能促进肿瘤细胞表达PD-L1，通过结合T细胞上的受体PD-1诱导CTL细胞失活与凋亡[2]，以上均可抑制免疫细胞的肿瘤免疫功能，导致乳腺癌细胞的免疫逃逸而获得增殖活性。

癌细胞过度增生导致的肿瘤微环境相对缺氧是癌组织进一步增殖所面临的障碍之一，HIF-1α能诱导间质血管生成，提高肿瘤血供，增加乳腺癌肿瘤微环境中的血氧水平，为乳腺癌生长提供营养支持。因此，抑制肿瘤血管生成是抗乳腺癌治疗的重要手段，由于抗血管生成药物Avastin通过中和VEGF分子的途径抗乳腺癌血管生成的疗效受到质疑，使得具有促进VEGF合成作用的HIF-1α基因成为关注热点之一[22]。开发以HIF-1α为靶点的小分子抑制剂，使其通过下调HIF-1α/VEGF级联反应抑制VEGF合成从而拮抗乳腺癌血管生成，对于乳腺癌，尤其是三阴性型乳腺癌的治疗具有重要价值。