CFTR 2562T>A位点多态性与急性胰腺炎风险的相关性

金 爽 金光军

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是由于多种病因引起的胰酶激活，导致胰腺局部发生炎性反应，严重情况下可以导致全身炎性反应综合征并发生器官功能障碍的疾病[1]，近年来急性胰腺炎的发生率逐渐上升，病死率也较高[2]。急性胰腺炎的发病机制比较复杂，其中遗传因素在急性胰腺炎的发生过程中具有重要作用，成为研究的热点[3,4]。囊性纤维跨膜转运调节因子(cystic fiber transmembrane transport regulatory factor，CFTR)是一种氯离子(Cl-)通道蛋白，具有调节Cl-和钠离子(Na+)交换的功能[5]。国外有研究者发现CFTR基因多态性与慢性胰腺炎相关[6,7]。目前国内还鲜有研究报道CFTR基因多态性与急性胰腺炎的相关性。本研究采用病例对照研究的方式分析CFTR基因rs1042077(2562T>A)位点单核苷酸多态性与急性胰腺炎风险的相关性，具体研究报告如下。

对象与方法

1.一般资料：选择2015年12月～2017年10月期间收治的AP患者100例作为研究对象，AP的诊断标准：(1)有符合AP特征的腹痛，如急性、持续、突发且剧烈的上腹疼痛。(2)血清淀粉酶或脂肪酶活性≥3倍正常值上限。(3)增强磁共振成像(MRI)检查或增强计算机断层扫描(CT)检查或者腹部的超声检查显示有AP影像学改变。考虑到临床工作中AP患者多为轻度AP，为了更好地研究FTR基因rs1042077(2562T>A)位点单核苷酸多态性与急性胰腺炎严重程度相关性，降低误差，笔者在纳入病例时尽量保证轻度、中重度、重度AP患者病例数接近，结合知情同意书的签署情况，最终入组的轻度AP(mild acute pancreatitis，MAP)23例，中重度AP(moderate severe acute pancreatitis，MSAP)42例，重度AP(severe acute pancreatitis，SAP)35例。MAP、MSAP、SAP的分级标准参考[8]。纳入标准：(1)符合AP的诊断标准。(2)年龄>18岁。(3)初诊为AP且发病后2天内入院治疗。排除标准：(1)肿瘤患者。(2)有重要脏器疾病、消化系统疾病。(3)妊娠期或哺乳期妇女。(4)精神类疾病患者。招募100例健康体检者作为对照组(health control，HC)。本研究中AP组和HC组一般资料详见表1，两组年龄、性别、体重指数(body mass index，BMI)、收缩压(systolic pressure，SBP)、舒张压(diastolic blood pressure，DBP)等一般资料之间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。本研究获得了医院医学伦理学委员会的批准，所有受试者均签署了知情同意书。

表1 研究组和对照组一般资料比较

BMI.体重指数；SBP.收缩压；DBP.舒张压

2.AP病情评价：采用Balthazar CT严重指数(CTSI)对AP患者的胰腺炎严重程度进行评分，0～3分表示为轻度、4～6分表示为中重度、7～10分表示为重度。使用APACHE Ⅱ评价AP患者的身体状况，包括急性生理学评分、年龄评分以及慢性生理学评分等3个维度。

3. CFTR基因型检测：提取所有受试者外周静脉血中基因组DNA，试剂盒为天根血液基因组DNA提取试剂盒(货号为DP318-02，批号为20150512100，公司为天根生物科技有限公司)。以提取的基因组DNA为模板，扩增含有CFTR基因rs1042077位点的目的片段，PCR扩增的引物序列为上游引物：5′-GAGAGCATACCAGCAGTGAC-3′；下游引物：5′-ACTAAGCACCAAATTAGCACAAA-3′。PCR反应程序设置为94℃变性5min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s；30个循环后72℃延伸5min，PCR产物保存在4℃冰箱，将PCR产物邮寄到上海生工生物工程有限公司，测序后使用Chromas 1.62分析测序结果(图1)。

图1 CFTR基因rs1042077(c.*2562T>A)位点不同基因型测序结果

结 果

1.CFTR基因rs1042077位点SNP与AP风险的相关性：CFTR基因rs1042077位点不同基因型频率符合Hardy-weinberg平衡(P>0.05)。AP组患者与HC组比较，CFTR基因rs1042077位点基因型和等位基因频率之间比较，差异有统计学意义(χ2分别为6.91、8.05；P值分别为0.03、<0.01)。以野生型(TT)为参考，杂合子(TA)频率在AP组和HC组之间比较，差异无统计学意义(OR=0.57，95%CI：0.30～1.10，P=0.07)，纯合子(AA)是AP发生的保护因素(OR=0.34，95%CI：0.12～0.93，P=0.02)。等位基因分析结果显示，A等位基因是AP发生的保护因素(OR=0.53，95%CI：0.34～0.85，P=0.01)，详见表2。

表2 CFTR基因rs1042077位点基因型和等位基因频率比较[n(%)]

AP.急性胰腺炎;HC.健康对照组;OR.比值比;CI.可信区间

2. CFTR rs1042077位点基因多态性与一般资料的相关性：分析CFTR rs1042077位点基因多态性与受试者年龄、性别、BMI、SBP、DBP等一般资料之间的相关性，野生型(TT)与突变型(TA/AA)的年龄、性别、BMI、SBP、DBP等一般资料之间比较，差异无统计学意义(P均>0.05)，详见表3。

表3 CFTR基因型与一般资料的相关性

BMI.体重指数；SBP.收缩压；DBP.舒张压

3.CFTR rs1042077位点基因多态性与APACHE Ⅱ评分和CTSI评分的相关性：分析比较AP患者CFTR rs1042077位点野生型和突变型患者的APACHE Ⅱ评分和CTSI评分，野生型AP患者APACHE Ⅱ评分和CTSI评分均显著高于突变型，差异有统计学意义(t=7.66、12.41；P均<0.01)，详见表4。

表4 AP组CFTR基因型与APACHE Ⅱ评分和CTSI评分的相关性

4.CFTR rs1042077位点基因多态性与AP严重程度相关性：本研究AP患者中35例SAP，42例MSAP，23例MAP，分析CFTR基因rs1042077位点多态性与AP严重程度相关性，CFTR基因rs1042077位点野生型和突变型基因频率在不同AP严重程度患者组之间的差异有统计学意义(t=19.82，P=0.000)，突变型(TA/AA)基因频率在SAP组和MSAP组中较低，详见表5。

讨 论

CFTR是胰腺、胆管和肠道等上皮细胞游离膜上的一种Cl-通道，具有调节离子浓度、水分流动和盐类离子转运的作用[9,10]。CFTR结构异常可能导致上皮层的离子和液体转运发生异常，使细胞内水分流失、分泌活动异常，导致局部组织阻塞继而发生感染[11]。

表5 CFTR rs1042077位点不同基因型频率在不同严重程度AP患者中的分布[n(%)]

SAP.重度AP;MSAP.中重度AP;MAP.轻度AP

自从CFTR基因被鉴定以来，该基因上有接近2000个突变类型被发现，包括点突变、小缺失突变等[12]。有多种疾病被发现与CFTR基因突变有关，如先天性双侧输精管缺如(CBAVD)、阻塞性精子症、播散性支气管扩张症、哮喘、慢性胰腺炎(CP)和新生儿高尿酸血症等[13～17]。CFTR基因rs1042077(2562T>A)位点位于7号染色体exon 14上，据1000 Genomes Project 数据库研究数据显示该位点突变在中国南方汉族人群中最小等位基因频率(MAF)为0.3857，本研究中健康对照组MAF为0.365，说明本研究所选择的人群具有一定的代表性，比较结果较为可靠。rs1042077位点在dbSNP中显示MAF为44%，在ClinVar中被解释为“良性/可能良性”。而本研究结果显示，在AP患者中，rs1042077位点MAF为0.235，且AP组患者与HC组比较，CFTR基因rs1042077位点基因型和等位基因频率之间的差异有统计学意义(P<0.05)，由此说明CFTR基因rs1042077位点单核苷酸多态性与AP的发生相关，具体表现为携带突变型A等位基因的群体可能比T等位基因携带者患AP概率更低。

本研究结果显示，CFTR基因rs1042077位点A等位基因是AP发生的保护因素。然而，目前对于CFTR基因突变的研究大多集中以下几个区域，如Vecchio-Pagán等[18]研究结果显示，CFTR基因A区域(chr7: 117039250～117053000)的调节基因座与汗液氯化物水平和肺功能相关，B区域(chr7: 116941750～116951750)、C区域(chr7: 117074250～117078000)、D区域(chr7: 117153000～117156750)与汗液氯化物水平相关，而E区域(chr7: 117010500～117014250)和F区域(chr7: 117159250～117164250)与肺功能相关。而国内外针对CFTR基因rs1042077位点的研究较少，从结构上看该位点不属于以上这几个区域，由于该位点突变频率较高，因此研究该位点与疾病的相关性具有显著的临床意义。

此外，分析不同临床参数群体间CFTR基因rs1042077位点基因型频率之间的差异，结果并未发现CFTR基因rs1042077位点基因多态性与年龄、BMI、SBP、DBP等之间具有相关性，说明CFTR基因rs1042077位点基因多态性对AP发生的影响与上述因子无关，通常单核苷酸多态性对表达的影响主要体现在结构、功能或者调控水平上，由于rs1042077位点T>A突变并未改变氨基酸的序列，笔者推测可能是影响了CFTR的表达水平。研究显示，CFTR蛋白在胰腺癌和慢性胰腺炎中呈现弱表达水平，显著低于正常胰腺组织，因此笔者认为rs1042077位点T>A突变可能影响CFTR表达调控过程，导致CFTR蛋白的表达水平升高，从而对AP的发生具有保护效应，但是还需要进一步开展体外实验予以证实。另外，本研究还分析了CFTR rs1042077位点基因多态性与AP严重程度的相关性，携带野生型(TT)的AP患者APACHE Ⅱ评分和CTSI评分均显著高于突变型，而突变型(TA/AA)基因频率在SAP组和MSAP组中较低，说明CFTR rs1042077位点单核苷酸多态性与AP的严重程度相关，突变型AP患者的病情比野生型轻。

本研究有以下不足之处，首先受样本量大小的限制，部分基因型受试者数量较少，这可能放大了统计学误差。另外，由于本研究未能在体外模型中检验CFTR rs1042077位点单核苷酸多态性与CFTR蛋白表达的相关性，因此对于CFTR rs1042077位点单核苷酸多态性与AP的相关性的机制缺乏直接的证据支持。

综上所述，CFTR基因rs1042077位点单核苷酸多态性与急性胰腺炎及其严重程度相关，突变型A等位基因可能是AP发生及其严重程度的保护因素，具体机制还需要进一步研究证实。