IL-22在大鼠牙周炎发展中时序性表达的研究

吴伟力 应于康 罗 军

牙周炎是一种以牙周支持组织慢性细菌感染为特征的疾病[1]。上皮屏障是防御细菌入侵的第一道防线，其完整性对于牙周疾病控制中起着至关重要的作用[2]。当上皮屏障被破坏时，形成牙周袋，微生物和结缔组织之间直接接触。白细胞介素-22(IL-22)是一种新发现的细胞因子，能诱导宿主防御反应，在糖尿病、风湿性关节炎、慢性鼻炎等疾病中都有发现，主要由CD4+T细胞分泌，同时Th-17和Th-22细胞也能分泌，主要调控上皮细胞的再生功能[3,4]。IL-22的调控作用是通过IL-22受体(IL-22R)来发挥作用，IL-22R由白细胞介素-22受体1(IL-22R1)和共享亚基白细胞介素-10受体2(IL-10R2)组成[5]。IL-22R1只在特定的组织(如黏膜和皮肤的上皮细胞)等表达[6]。同时，IL-22结合蛋白(IL-22BP)也可以与IL-22 结合，抑制IL-22与IL-22R结合，IL-22的功能结果取决于IL-22R1和IL-22BP的水平之间的平衡[7，8]。目前，关于IL-22及其受体在牙周炎发生、发展过程中的作用研究较少。因此，本研究通过探讨不同牙周炎病理时期组织学改变和IL-22、IL-22R1和IL-22BP的表达，旨在为牙周炎的诊疗带来新的思路。

材料与方法

1.实验动物:选取体重(200～240g)的雄性健康8周龄SD大鼠30只，购自山东省医学科学院实验动物中心提供，实验动物许可证号: SCXK(鲁)2012-0002，动物合格证编号：2005001。动物饲养在温度为22～24℃、噪声≤50dB、相对湿度为40%～70%的SPF环境中，动物相关处置均符合《中华人民共和国实验动物管理条例》要求，适应性喂养1周后进行实验。

2.实验试剂:牙龈卟啉单胞菌购自上海北诺生物科技有限公司，批号：LLL661；水合氯醛购自上海上药新亚药业有限公司，批号：781200008；硫酸卡那霉素购自江西制药有限责任公司，货号：14200204181；Trizol Reagent RNA提取试剂盒购自美国Invitrogen公司，货号：15596018；Prime Script RT reagent Kit Perfect real-time RNA反转录试剂盒、Ultra SYBR One Step RNA PCR Kit荧光定量PCR试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司，货号：RR047A、TK08045；PCR引物序列购自日本TaKaRa公司：IL-22上游引物：5′-AAGCTCAGCAGTCACCTCA-3′,下游引物：5′-GGGACATAAACAGCAGATCCA-3′；IL-22R1上游引物：5′-TGGTCCCCCAGCAGTCATTT-3′，下游引物：5′-TCTTGACCACTGCCACAGAAA-3′；IL-22BP上游引物：5′-CCCGTTGCTTTTCCTCTGG-3′，下游引物：5′-ATCCCACTCGTAGCCCCTCT-3′；beta-actin引物序列：上游引物：5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游引物：5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′；IL-22、IL-22R1、IL-22BP ELISA 试剂盒购自欣博盛生物科技有限公司，货号：MM-0670R2、MM-0670R1、MM-0670R22。

3.实验仪器：体视显微镜Stemi 2000购自奥地利SEZ公司；光学生物学显微镜购自日本Nikon公司；NanoDrop2000c 型蛋白核酸检测仪购自美国Thermo公司；实时荧光定量PCR仪购自美国BIO-RAD公司。HBS-1096B 酶标仪购自南京德铁实验设备有限公司；台式冷冻离心机Sorvall STR ATOS购自德国Heraeus公司；5.0 丝线购自江苏泗洪金睛医疗器械有限公司。

4.实验分组及造模：采用数字法将SD大鼠随机均分为5组，即对照组、建模1周组、建模2周组、建模3周组、建模5周组，每组6只。造模前3天给予硫酸卡那霉素水溶液(1g/L)喂养除菌。禁食12h后用10%水合氯醛(3.33ml/kg)腹腔注射麻醉后，采用高糖饮食+丝线结扎+接种牙龈卟啉单胞菌的方法造模。丝线结扎双侧上颌第一磨牙上，将丝线推入龈沟深部，在龈沟内接种1.5×109CFU/ml的牙龈卟啉单胞菌，结扎后给予50g/L高糖水替代饮用水。每隔1天接种1次牙龈卟啉单胞菌。在各时间节点分别取双侧上颌软组织，一侧置于Trizol液中，另一侧不加处理，均放于-80℃保存备用；剔除上颌软组织，一侧上颌骨置于双氧水(3%)中，另一侧置于多聚甲醛液(4%)中，24h后进行脱钙。

5.HE染色观察牙周组织病理改变：取脱钙的上颌组织进行脱水、包埋、切片(3μm)、HE染色、封片后在光学显微镜下观察牙周组织病理改变并拍照。

6.检测牙槽骨吸收：取置于双氧水中上颌骨，用漂泊剂(10g/L)浸泡1min，刷洗去除软组织，用亚甲蓝(10g/L)染色1min，用蒸馏水冲洗，晾干后用体视显微镜下观察并拍照，用 Image J软件计算腭侧多边形面积。

7.ELISA法检测上颌软组织中IL-22、IL-22R1、IL-22BP的含量：取适量上颌软组织，用磷酸盐缓冲液清洗，制成匀浆，吸取上清液进行实验。根据ELISA试剂盒说明书进行IL-22、IL-22R1、IL-22BP含量测定。

8.RT-PCR检测上颌软组织中IL-22、IL-22R1、IL-22BP mRNA的表达：取置于Trizol液中的上颌软组织，依据试剂盒说明书进行总RNA的提取和cDNA的合成，进行PCR扩增，对其表达量进行结果分析，β-actin作为内参，采用 2-△△Ct法计算mRNA 的相对表达量。

结 果

1.各组HE染色结果:对照组牙周组织没有发现炎症和软组织损伤；在建模1周可以观察到上皮损伤好轻度炎性细胞浸润；建模第2周逐渐加重，在建模第3周达到高峰期，上皮屏障的完整性被破坏；建模第5周炎症减轻，上皮细胞增生和屏障完整性的恢复，从而形成了牙周袋,详见图1。

图1 各组HE染色结果(×20)A.对照组;B.牙周炎1周组;C.牙周炎2周组;D.牙周炎3周组;E.牙周炎5周组

2.各组牙槽骨吸收比较:与对照组比较，各牙周炎组大鼠牙槽骨吸收明显，根分叉逐渐暴露，腭侧多边形面积增加，差异有统计学意义(P<0.05)；随着造模时间的延长，牙槽骨吸收逐渐加重、腭侧多边形面积增加，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1、图2。

表1 各组牙槽骨吸收比较

与对照组比较，*P<0.05；与建模1周组比较，#P<0.05；与建模2周组比较，ΔP<0.05

图2 各组牙槽骨吸收比较(×10)A.对照组;B.建模1周组;C.建模2周组;D.建模3周组;E.建模5周组

3.各组上颌软组织中IL-22、IL-22R1、IL-22BP的含量:与对照组比较，各牙周炎组大鼠上颌软组织中IL-22和IL-22R1 含量增加，IL-22BP 含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)；随着造模时间的延长，IL-22和IL-22R1 含量增加，在第3周达到高峰，第5周含量有所降低，差异有统计学意义(P<0.05)；IL-22BP 含量降低，在第3周达到低谷，第5周有所增加，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

4.各组上颌软组织中IL-22、IL-22R1、IL-22BP mRNA的表达:与对照组比较，各牙周炎组大鼠上颌软组织中IL-22和IL-22R1 mRNA相对表达量增加，IL-22BP mRNA相对表达量降低，差异有统计学意义(P<0.05)；随着造模时间的延长，IL-22和IL-22R1 mRNA相对表达量增加，在第3周达到高峰，第5周有所降低，差异有统计学意义(P<0.05)；IL-22BP mRNA相对表达量降低，在第3周达到低谷，第5周有所增加，差异有统计学意义(P<0.05)，详见表3。

表2 各组上颌软组织中IL-22、IL-22R1、IL-22BP的含量

与对照组比较，*P<0.05；与建模1周组比较，#P<0.05；与建模2周组比较，ΔP<0.05；与建模3周组比较，▲P<0.05

表3 各组上颌软组织中IL-22、IL-22R1、IL-22BP mRNA的表达

与对照组比较，*P<0.05；与建模1周组比较，#P<0.05；与建模2周组比较，ΔP<0.05；与建模3周组比较，▲P<0.05

讨 论

牙周炎是一种感染性疾病，主要表现为牙齿支持组织侵犯性的破坏[9]。IL-22具有抗菌作用，增强细胞再生能力，保护组织受损，在维持黏膜屏障的完整性和对感染控制方面起着关键作用[10,11]。基于以上研究基础，本研究对牙周炎的老鼠IL-22以及其受体、组织学改变情况。结果显示，炎症在第3周达到顶峰，之后到第5周可认为是一个恢复阶段，同时出现了上皮细胞增生。同时，从第1周到第3周，上皮组织的完整性破坏越来越严重，牙槽骨丢失的数量仍然呈指数增长。提示上皮屏障的破坏、黏膜免疫的增强和骨吸收增强三者之间的关系是相辅相成的。通过对牙槽骨吸收相关研究的搜索可以发现，炎症使上皮屏障受到破坏，病原菌与组织直接接触，诱导了破骨细胞的形成并增加破骨细胞的活动，使牙槽骨丢失[12～14]。因此，本研究结果表明，上皮组织内部结构改变可能对骨骼吸收有影响。

本研究对大鼠上颌软组织中IL-22、IL-22R1 mRNA和蛋白的检测中发现，IL-22、IL-22R1表达水平也有和组织学改变相同的趋势。基于IL-22具有促进上皮细胞再生和保护组织受损的功能，本研究显示，当机体受到细菌感染时，宿主可能会产生更高水平的IL-22来恢复上皮的屏障作用。在对炎性肠病和实验性自身免疫性心肌炎的研究中也可以看到类似的情况，并证明了IL-22的作用[15，16]。同时，牙周炎患者的唾液中也发现IL-22的比率较正常人升高，提示 IL-22可能参与牙周炎免疫反应[17]。有研究者提出IL-22的表达水平可作为牙周组织破坏程度的指标，因为IL-22牙周组织中的表达与牙周炎的严重程度呈正相关，控制IL-22的水平对牙周炎的治疗有积极的意义[18]。IL-22属于IL-10细胞因子家族，IL-22功能的发挥需要通过与IL-22R1的结合来实现，IL-22BP可以与IL-22R1竞争性地IL-22结合，使IL-22失活，同时，IL-22BP与IL-22的结合能力比IL-22R1强[19]。所以，IL-22的活性主要取决于能否与IL-22R1相结合，而IL-22BP被认为是IL-22失活的天然中和抗体。在对胃癌的研究中发现，IL-22BP水平降低可以推动IL-22不受控制的促进细胞增殖，导致胃炎相关模型修复阶段癌症的发生。IL-22和IL-22R1相同趋势的原因可能与IL-22诱导的正反馈调节增加IL-22R1的表达，IL-22BP则相反。这一结论在葡聚糖硫酸钠诱发结肠炎模型中得到证实。

综上所述，本研究确定了在大鼠的实验性牙周炎中上皮细胞的组织病理变化过程及IL-22、IL-22R1和IL-22BP时序性表达情况，可为牙周炎的诊疗带来新的思路。但本研究不能证明IL-22、IL-22R1和IL-22BP是否与上皮细胞增殖有关，需要笔者在今后的研究中予以证实。