炎性小体在右美托咪定减轻大鼠肾缺血再灌注损伤中的作用

王全胜 艾热提 路菲菲

急性肾损伤是临床手术的常见并发症，其可显著增加慢性肾脏疾病和患者死亡的风险[1]。炎性小体(NLRP3)是免疫炎性反应的重要组成部分，参与了急性肾损伤、糖尿病肾病及慢性肾脏病的发生、发展过程[2～4]。有研究显示，NLRP3的激活可导致促炎细胞因子如白细胞介素-1β(IL-1β)和IL-18的合成与分泌，引发肾脏炎性反应和纤维化[5]。右美托咪定是一类高选择性的α2肾上腺素能受体激动剂，其受体广泛分布于肾脏近曲和远曲小管[6]。动物实验研究表明，右美托咪定可显著减轻重要脏器如心脏、肝脏、肾脏等缺血再灌注损伤，及其引发的炎性反应和细胞凋亡、坏死[7～9]。右美托咪定能否通过降低NLRP3表达，减轻肾缺血再灌注损伤，目前研究尚不清楚。因此，本研究拟评价右美托咪定在肾缺血再灌注损伤中的保护作用及其与NLRP3的关系。

材料与方法

1.实验动物及模型建立:SD清洁级雄性大鼠32只(12～14周，体质量230～250g)由新疆医科大学实验动物中心提供，动物实验合格证：SCXK(新)2011-0004。采用数字表法随机分为4组，即假手术组(Sham组,n=8)、肾缺血再灌注损伤组(I/R组,n=8)、肾缺血再灌注损伤+右美托咪定预处理组(I/R+Dex预处理组,n=8)和肾缺血再灌注损伤+右美托咪定后处理组(I/R+Dex后处理组,n=8)。大鼠肾缺血再灌注损伤模型参考文献[10]。简要操作如下：经腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg，美国Sigma公司)麻醉大鼠后，经腹部正中切开，暴露双侧肾脏，分离肾蒂。Sham组为仅暴露分离双侧肾蒂后，关闭腹腔；I/R组为夹闭双侧肾蒂，阻断供血45min后，松开血管夹，再灌注24h；I/R+Dex预处理组为缺血前1h腹腔注射右美托咪定(美国Pfizer公司)10μg/kg；I/R+Dex后处理组为再灌注后1h腹腔注射右美托咪定10μg/kg。再灌注24h后收集上述各组肾脏组织标本。

2.血肌酐和尿素氮水平检测:各组大鼠于肾缺血再灌注24h后鼠尾静脉血，1500×g离心5min，取上清，采用全自动生化分析仪(美国Beckman公司)检测各组血清上述指标。

3.TNF-α和IL-10的水平的检测：各组大鼠于肾缺血再灌注24h后鼠尾静脉血，1500×g离心5min后，取上清，采用ELISA试剂盒(南京建成生物技术公司)检测各组大鼠炎性指标如TNF-α和IL-10水平。

4.TUNEL染色:取上述肾脏组织标本，经石蜡切片，加入20μg/ml不含DNA酶的蛋白酶K，采用TUNEL试剂盒(德国Roche公司)提供的检测液，加入50μl，室温孵育。用抗荧光淬灭封片液封片后观察，每张片放大400倍，随机取5个视野，进行凋亡细胞(棕褐色或棕黄色颗粒)和总细胞计数，细胞凋亡指数(%)=凋亡细胞计数÷总细胞计数×100%。

5.免疫印迹法检测肾脏NLRP3、凋亡信号(caspase-1、Bcl-2)的表达水平:提取各组大鼠肾脏组织蛋白，50μg组织蛋白于10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移置硝基纤维素膜，给予5%脱脂牛奶封闭2h，分别孵育鼠抗NLRP3抗体(1∶400，英国Abcam公司)、caspase-1抗体(1∶300，英国Abcam公司)、Cleaved caspase-1抗体(1∶400，英国Abcam公司)、Bcl-2抗体(1∶400，美国Cell Signaling Technology公司)及抗GAPDH抗体(1∶400，美国Santa Cruz Biotechnology公司)，4℃避光孵育过夜。次日取出膜，给予避光室温孵育荧光羊抗兔二抗(1∶11000)，采用凝胶成像系统测定蛋白条带灰度值，以GAPDH为内参，并计算目的条带与GAPDH灰度比值。

结 果

1.各组大鼠肾功能水平比较:与Sham组比较，I/R组、I/R+Dex预处理组及I/R+Dex后处理组血肌酐和尿素氮水平均明显升高(P<0.05)；与I/R组比较，I/R+Dex预处理组和I/R+Dex后处理组血肌酐和尿素氮水平均明显降低(P<0.05)；而I/R+Dex预处理组和I/R+Dex后处理组比较，血肌酐和尿素氮水平差异无统计学意义(P>0.05)，详见表1。

表1 各组大鼠肾功能水平比较

与Sham组比较，*P<0.05；与I/R组比较，#P<0.05

2.各组大鼠血清炎性因子水平比较:与Sham组比较，I/R组、I/R+Dex预处理组及I/R+Dex后处理组血清TNF-α和IL-10水平均明显升高(P<0.05)；与I/R组比较，I/R+Dex预处理组和I/R+Dex后处理组上述指标均明显降低(P<0.05),详见表2。

表2 各组大鼠血清炎性因子水平比较

与Sham组比较，*P<0.05；与I/R组比较，#P<0.05

3.各组大鼠肾小管细胞凋亡水平比较:Sham组未发现明显的肾小管细胞凋亡，而I/R组、I/R+Dex预处理组及I/R+Dex后处理组较Sham组肾小管细胞凋亡明显增多(P<0.05)；而与I/R组比较，I/R+Dex预处理组和I/R+Dex后处理组肾小管细胞凋亡明显减少(P<0.05,图1)。

图1 各组大鼠肾小管凋亡水平(×400)A.Sham组；B.I/R组；C.I/R+Dex预处理组;D.I/R+Dex后处理组

4.各组大鼠肾组织NLRP3、caspase-1、Cleaved caspase-1和Bcl-2表达水平:与Sham组比较，I/R组肾组织NLRP3、caspase-1、Cleaved caspase-1表达水平均明显升高，而Bcl-2表达明显降低(P<0.05)；与I/R组比较，I/R+Dex预处理组和I/R+Dex后处理组肾组织NLRP3、caspase-1、Cleaved caspase-1表达水平明显降低，Bcl-2表达明显升高(P<0.05)，详见图2。

图2 各组大鼠肾组织NLRP3、Cleaved caspase-1、caspase-1和Bcl-2表达水平与Sham组比较，*P<0.05；与I/R组比较，#P<0.05

讨 论

相关研究显示，右美托咪定可保护重要脏器如肾脏、肝脏及心脏等缺血再灌注损伤，但机制还不完全清楚[11～13]。本研究结果显示，右美托咪定保护肾脏缺血再灌注损伤与降低NLRP3表达有关。肾脏缺血再灌注损伤可增加NLRP3和caspase-1的水平，而给予右美托咪定处理，可显著逆转上述作用，同时降低体内炎性水平，表现为TNF-α降低和IL-10的升高。

血肌酐和尿素氮水平是临床评判肾功能的重要指标，在急性肾损伤、慢性肾功能不全等，可显著升高。本研究通过建立肾脏缺血再灌注损伤模型，结果显示，与Sham组比较，I/R组血肌酐和尿素氮水平显著升高，表明肾缺血再灌注引起了肾功能显著受损，提示模型制备成功。NLRP3是由胞质内多种蛋白质组成的复合体，其含有凋亡相关微粒蛋白、caspase-1等，是天然免疫系统的重要组成部分。当NLRP3受外在刺激被激活时，活化的caspase-1随后激活IL-1β和IL-18，产生炎性级联反应[14]。相关研究显示，NLRP3可促进肾脏相关疾病如慢性肾功能不全及糖尿病肾病的进展，同时其可作为潜在的治疗靶点[15,16]。抑制NLRP3激活可显著降低糖尿病肾病的炎性反应，改善肾功能及预后[17]。

右美托咪定是高选择性的α2肾上腺素能受体激动剂，具有镇静、镇痛及抗交感作用，同时其受体在肾脏具有广泛分布，对肾脏缺血再灌注损伤具有显著保护作用，但机制不清。已有研究表明，右美托咪定通过调节细胞凋亡，降低炎症及氧化应激，从而对重要器官缺血损伤起保护作用[18]。因此，笔者假设通过抑制NLRP3，降低炎症及细胞凋亡，可能参与了右美托咪定对肾脏缺血再灌注损伤的保护作用。本研究发现，肾脏缺血再灌注损伤可显著增加NLRP3、caspase-1及Cleaved caspase-1的表达，而右美托咪定可显著抑制NLRP3激活，降低炎性反应即TNF-α降低而IL-10升高，进一步抑制凋亡通路的激活。TNF-α和IL-10是单核-吞噬细胞产生的重要炎性因子，可进一步刺激中性粒细胞分泌趋化因子及黏附因子，介导炎性反应的放大[19]。以往研究显示，炎症可促进细胞凋亡，而细胞凋亡是器官缺血再灌注损伤的主要机制之一，在细胞凋亡通路中，caspase-1是重要的剪切酶，抑制caspase-1活性可显著减轻细胞凋亡[20]。本研究结果显示，肾脏缺血再灌注损伤时，其体内炎性反应显著增强，进而引起肾小管细胞凋亡明显增多，导致肾功能受损。

综上所述，NLRP3与大鼠肾缺血再灌注损伤的发生、发展密切相关，右美托咪定可能通过降低NLRP3表达，改善炎症及细胞凋亡，从而保护肾缺血再灌注损伤。