禽多杀性巴氏杆菌菌株的分离及荚膜与脂多糖分型鉴定——以2009-2017年华东地区为例

高明燕 韦玉勇 周 生 徐 步

中国农业科学院家禽研究所，江苏扬州225125

20世纪70、80年代，禽霍乱对国内的养禽业造成了巨大的经济损失。随着规模化养殖技术的提高，抗生素在临床的应用以及生物安全措施的重视，该病的危害大大降低,但有关该病的病例报道还时有发生。为深入了解当前家禽养殖业中禽多杀性巴氏杆菌病流行情况，笔者在2009-2017年共9年间对江苏、安徽、山东、浙江等地区进行了流行病学调查。共采集1 556 份禽霍乱临床疑似病例，同时进行了Pm 菌株分离。采用菌落特征观察、革兰氏染色、生化试验及Pm 种特异性PCR 等方法进行菌株鉴定，并对这些菌株进行荚膜血清型和LPS 基因型分型，为该病的流行病学监测和疫苗的筛选与研制奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 病 料

采样时间：2009-2017年。

病料来源:江苏、安徽、山东、浙江等地区1 556份临床禽霍乱疑似病例，主要是肝脏、脾脏、心血等病料。

1.2 参考菌株

国内强毒标准株C48-1（A:1）；荚膜血清型参考株CVCC390(A)、CVCC391(B)、CVCC392(D)；Heddleston 菌体血清型参考株CVCC410（1 型，属于LPS 基因型L1）、CVCC412（3 型，属于LPS 基因型L3）、CVCC413（4，属于脂多糖基因型L3），均源自中国兽医药品监察所。

1.3 试 剂

脑心浸液BHI (brain heart infusion )培养基、脑心浸液琼脂BHIA(brain heart Infusion agar)培养基为美国BD 公司产品；普通营养琼脂、血琼脂基础、普通肉汤、麦康凯培养基、三糖铁培养基以及生化发酵管均购自杭州微生物试剂有限公司。聚合酶、DNA Marker 为宝生物工程（大连）有限公司产品。

1.4 菌株分离与鉴定

1）触片检查。将疑似禽霍乱病死禽用手术剪刀解剖，暴露出内脏组织；灼烧剪刀并把心脏内壁剪一个小口，用接种棒蘸取少量心血涂在载玻片上制成心血涂片；同时无菌剪取肝脏和脾脏病变组织各一小块制成触片；然后将上述涂片和触片进行革兰氏染色。

2）细菌分离培养及生化特性。按上述无菌操作从病死禽的心血、肝脏和脾脏取样，接种于BHIA 平板，37 ℃培养18～24 h；挑选单个菌落进行纯培养，在45°折光光源下，用立体显微镜观察菌落的大小、形态、结构及虹彩。将上述分离菌株转接种于普通营养琼脂、血琼脂、麦康凯培养基、三糖铁培养基等的平皿上，置37 ℃培养18～24 h，观察菌落在各个平皿上的生长状况。挑取上述菌株的单个菌落，分别接种于各微量生化发酵管内，置37 ℃培养24～48 h，定时检查反应结果。

1.5 菌种特异性PCR 鉴定

BHI 或BHIA 平板培养分离的菌株，直接取菌液或平板上的单菌落直接进行PCR。按参考文献[5]合成针对禽Pm 菌株KMT1 基因的特异性引物KM T1T7：ATCCGCTATTTACCCAGTGG 和KMT1SP6：GCTGTAAACGAACTCGCCAC。PCR 扩增50 μL 体系：Premix Ex Taq混合物25 μL，模板1 μL，上下游引物各2 μL，ddH2O 20 μL。PCR 扩增条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃30 s，72 ℃1 min，35 个循环，最后72 ℃延伸10 min。经1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。

1.6 多重荚膜PCR 鉴定

按参考文献[5]的方法合成针对荚膜A、B、D、E、F 的5 对引物；采用参考文献中的反应体系和反应条件进行PCR 扩增；用琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物的大小。

1.7 LPS-mPCR 分型

按参考文献[4]中的方法合成针对LPS 基因型L1～L8 的引物；并采用该文献中的反应体系和反应条件对分离株进行LPS-mPCR 扩增，1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。

2 结果与分析

2.1 菌株分离与鉴定

根据菌株的革兰氏染色、菌落特征以及生化培养结果，依据参考文献[6]的标准初步判定共分离多杀性巴氏杆菌102 株。

2.2 种特异性PCR 鉴定

初步鉴定为禽Pm 分离株的菌液或菌落PCR 扩增并电泳发现，扩增产物与预期结果相符，均出现一条460 bp 的条带（部分菌株的结果见图1）。这进一步确定本所收集和分离的102 个分离株均为Pm。

2.3 多重荚膜PCR 鉴定

利用多重荚膜PCR 方法将102 个Pm 菌株进行荚膜血清型分型，扩增结果发现其中92 株Pm 为荚膜A 型，条带为1 044 bp，10 株无法定型（部分菌株的扩增结果见图2）。表明该地区流行的禽Pm以A 型为主。

图2 部分Pm 菌株荚膜PCR 结果

2.4 LPS-mPCR 分型结果

利用LPS-mPCR 方法对分离的102 个Pm 菌株进行LPS 分型鉴定，结果见图3。图3显示，这些菌株可以分为2 种LPS 型，分别为L1 和L3 型。其中L1 型98 株，L3 型4 株。

图3 部分Pm 菌株LPS-mPCR 结果

3 讨 论

前人对多杀性巴氏杆菌分型进行了诸多研究，其中Carter 用间接血凝实验将Pm 荚膜型分为A、B、D、E 这4 个血清型，后来又从火鸡上鉴定出F型；Townsend 等[5]研究表明，A、B、D、E、F 菌株的生物合成位点的基因分别是hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ、fcbD 等，针对这几种荚膜合成基因位点设计引物，扩增出的片段大小分别为1 044、760、657、511、851 bp；由此建立了荚膜分型PCR。1972年Hed dleston 建立的耐热抗原琼脂扩散沉淀将Pm 菌株分为16 个（1～16）血清型[7]。通过对Pm 这16 个Heddleston 菌体血清型的脂多糖外核心寡糖的基因和化学结构进行分析，结果表明，仅有8 个特有的脂多糖外核生物合成位点[8]。针对这8 个合成位点建立了脂多糖多重PCR，用于区分Pm 的LPS 基因型[7]，其中L1 型包括血清型1 和14 型，L3 型包括血清3 和4型。荚膜多重PCR、脂多糖多重PCR 方法的建立逐渐代替之前的繁琐的血清学方法而应用于Pm 的检测、鉴定和分型中，本研究也采用这2 种方法对分离的菌株进行荚膜PCR 和脂多糖基因型分型。

本研究从2009-2017年共9年间从江苏等省份共1 556 份病料样品中分离102 株Pm 菌株，分离率为6.56%。其中鸡分离53 株、鸭分离28 株、鹅分离21 株。所分离的菌株有92 株属于A 型，有10株未定型；而脂多糖多重PCR 分型结果发现其中98 个Pm 分离株属于L1 型，这表明该地区禽Pm 菌株主要为脂多糖L1 型，对应的菌体血清型为1 型；此外还存在4 株L3 型，对应的血清型为3 或4 型。这与国内其他研究相符合[9]。

调查发现：禽霍乱的发病率大幅减低，一般养殖规模较小，生物安全措施不到位的小型养殖场、养殖户家禽发病率较高；禽群中鸡、鸭、鹅发病率均较高，鸡发病多在90～120日龄；发病季节以气候多变的春季和高温、潮湿、多雨的夏、秋两季为主。

因为家禽生产上使用的禽霍乱疫苗菌株陈旧，免疫效果不理想，而临床上接种比例非常低，再加上饲料里普遍添加药物以及临床上抗生素的滥用，所以禽霍乱一般与其他疾病混合感染或继发感染。这也造成Pm 菌株抗生素耐药性提高，临床治疗难度增加。根据本研究流行病学调查的结果以及目前国内养殖行业无抗生产的要求分析，禽霍乱需要全面更新疫苗菌株，采用流行菌株制备动物疫苗，并加强生产管理，采用综合的生物安全措施来进行防控。