1例弓形虫病的PCR鉴定与诊治

舒鑫标 娄昆鹏

1．浙江大飞龙动物保健品股份有限公司，浙江金华321017；2．扬州大学兽医学院，江苏扬州225009

弓形虫病又称弓形体病, 是由刚地弓形虫寄生在猪、牛、羊、狗、猫和人体内而引起的一种人畜共患的专性细胞内寄生原虫病。猪的弓形虫感染率较高，为3.32%～66.39%[1]。近年来猪弓形虫病暴发较多,特别是种猪,由于生活周期长,感染机会多,天气骤冷、更换饲料等应激容易诱发疫情。根据流行特点,本病多发生在5-10月,夏季发病率最高，寒冷的冬季也有发生。现将浙江某猪场冬季母猪爆发弓形虫病病例诊治和防控措施报告如下：

1 发病情况

2018年12月，浙江某存栏300 余头母猪场，第2 栋限位栏母猪开始有几头不吃料，后蔓延至整栋限位，很多母猪均有厌食情况。患猪出现气喘、咳嗽等症状，刚开始猪场技术人员按照猪流感进行治疗，添加荆防败毒散和阿莫西林进行治疗，结果无效。12～24 h 后母猪陆续出现流产，流产胎儿潮红且体表有针尖状出血点。流产母猪以2～4 胎较多，流产后母猪症状有所减轻。第2 天第1 头母猪死亡，保育猪亦有伤亡。之后猪场技术人员又按照蓝耳病对患病猪只进行处理，添加替米考星等，注射头孢、氟苯尼考等均未见到明显效果。至笔者接到案例时发病已3 周，病猪流产比例占孕猪总数超过10%，流产、返情比例和弱仔比例明显高于平时。

2 临床症状

病猪体温40～42 ℃，呈稽留热，眼结膜潮红，分泌物增多；精神萎靡，减食或食欲废绝，个别呕吐，喜卧，被毛粗乱，大便秘结如栗，尿液茶褐色。病猪呈现明显的呼吸道症状，呼吸急促，兼有咳嗽，呈腹式呼吸，严重的张口呼吸，呈犬坐姿势，流浆液性、粘液性鼻液。耳根、鼻端、腹内侧呈现红紫色斑块，兼有出血点，严重的甚至遍布全身。有的后躯麻痹、运动障碍。发病保育猪腹股沟及颌下淋巴结肿大，后期卧地不起、体温下降，最终衰竭死亡，部分病猪濒死期嘴角流出血色泡沫。

3 病理变化

剖检病死母猪仔猪共5 头，腹下和四肢内侧皮肤多见紫红色斑块。全身淋巴结特别是肺门、肝门和肠系膜淋巴结肿大，切面出血、有灰白色坏死。胸腔和腹腔大量积液、呈淡黄色。心肌柔软、外膜有少量出血点、心耳出血。肺脏肿大，呈暗红色，间质增宽，充满半透明胶冻样渗出物，切面流出红黄色泡沫液体。肝脏肿大、色暗红，有大量白色或灰黄色小米粒样坏死结节。肾脏表面有针尖大小出血点。脾脏肿大，棕红色，表面有结节样出血性梗死。胃底潮红、充血、出血。

4 实验室诊断

4.1 涂片染色镜检

无菌操作取病猪肺、肝、淋巴结做涂片，用姬姆萨染色液染色后，油镜下检查发现月牙形或梭形的弓形虫虫体，核为红色，细胞质为蓝色。

4.2 细菌培养

无菌操作取病死猪肝、脾、淋巴组织分别涂抹接种普通营养琼脂、鲜血营养琼脂平板，37 ℃培养，观察至48 h，无细菌生长。

4.3 PCR 鉴定

无菌条件下采取13 头病死猪心脏血液，以弓形虫（TP）1 基因作为分子标记建立PCR 检测[2]。同时用PCR 方法检测猪伪狂犬病毒（PRV）、圆环病毒2 型（PCV2）、细小病毒（PPV）。用RT-PCR 方法检测猪蓝耳病毒（PRRSV）和猪瘟病毒（CSFV），参考浙江省农业科学院猪病检测室诊断方法设计引物，由上海生工生物工程有限公司合成，引物名称、序列及预期片段大小如表1。检测结果见图1。

抗原PCR 检测结果见表2。由表2可知，13 个样品的猪蓝耳病毒、圆环病毒2 型、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、细小病毒抗原检测均为阴性，说明此次疫情并非上述疾病引起，而弓形虫抗原检测阳性数为11 个，占比84.6%（11/13）。结合临床症状、病理变化和实验室诊断，确诊该病为猪弓形虫病。

表1 引物名称、序列及预期片段大小

图1 PCR 检测电泳图谱

表2 抗原PCR 检测结果统计

5 防治措施

立即将病猪与假定健康、精神状态好的猪隔离，单独饲养，对病程长、严重的和治疗效果不佳的猪进行淘汰并作无害化处理。降低猪舍湿度，保持猪舍清洁干燥，全进全出，定期用3%氢氧化钠溶液对墙面、地面、器具和粪沟彻底消毒，用聚维酮碘对猪喷雾消毒。猪场禁止养犬、猫，做好灭鼠工作。全群投喂“弓连优”（浙江某兽药厂家生产，通用名复方磺胺甲恶唑粉），按照说明书治疗量使用，每吨饲料添加1 kg，另等量添加碳酸氢钠，以减少对泌尿道的不良反应，连用7 d。饮水中添加葡萄糖和电解多维，连用14 d。对采食量低、发热的患病猪按照每千克体质量0.1 mL 剂量肌肉注射“联合黄安”（浙江某兽药厂家生产，通用名磺胺间甲氧嘧啶注射液），首次用量加倍。同时配合柴胡注射液使用，1 次/d，连打3 d。用药4 d 后，不再有新增病例，采食量逐渐增加，患猪体温逐渐恢复正常，7 d 后大群精神状态恢复正常。

6 讨 论

猪弓形虫病多在炎热的夏季发病，本次为冬季发病，此种情况少见。通过现场调查发现，猪场卫生状况不佳，未及时清理的粪污点较多，新粉碎的配合料杂乱堆放并有暴露。据饲养员介绍，猪场内及猪圈舍经常有野猫出入，在猪场饲料房也能看到疑是猫粪的动物粪便。从天气看，发病期间阴雨连绵，气温较低，猪圈舍密闭开启暖风机，温度适宜，但湿度大，上述状况都为虫体滋生创造了条件，是否猪采食污染猫粪的饲料或由饮水导致发病有待进一步考证。

弓形虫病是一种危害很大的人兽共患病，人和动物感染弓形虫很常见[3]。研究弓形虫病具有重要的公共卫生意义。孕妇若妊娠前3 个月感染弓形虫可引起流产、胎儿畸形或产出弱智儿[4]。目前随着家庭宠物犬猫饲养量的增加，人类与宠物密切接触的机会增多，弓形虫的感染率有逐年增加的趋势[5]。弓形虫感染成人后，可侵害神经系统、呼吸系统、心脏、淋巴内皮系统等多种器官或系统，并造成损伤，严重时会造成死亡。弓形虫能感染大部分温血动物，可致孕畜流产死胎，急性弓形虫病可造成家畜的死亡，猫科动物是弓形虫终末宿主，猫在该病的流行和传播中起重要作用。因此，猪场禁止养猫、严防野猫及排泄物污染饲料及饮水；做好灭鼠工作，禁止猪接触老鼠或其他动物尸体；禁止屠宰下脚料和生肉汤水喂猪；流产母猪胎衣、胎儿焚烧处理，以防猪吃到患病或带虫动物体内的滋养体和包囊而感染。北方部分养猪场有从周边农户购买散装玉米的习惯，猪场若发生疑是弓形虫病时应格外注意留意饲料粮是否被猫粪污染。

弓形虫的高热、全身紫红和呼吸道表现，虽然有一定示病意义，但因与猪瘟、蓝耳病、链球菌病、猪肺疫等临床表现有诸多相似之处，难以区分，往往容易误诊漏诊。如条件允许，建议进行实验室镜检和PCR 鉴定，以确定病原[6]。目前，有关弓形虫的研究大量集中于猪血清中弓形虫抗体方面，这些方法并不能准确反映猪体弓形虫的感染状况[7-8]。随着PCR 技术的快速发展，对弓形虫感染组织的检测敏感度已经能够达到0.05 个速殖子水平[9]。但因PCR检测所需组织样本较小，而且慢性感染的动物一般在脑部形成组织包囊，这给阳性组织的寻找带来了一定困难，容易造成漏检。如何解决这方面的问题将是未来弓形虫检测的重点。

绝大多数抗生素对弓形虫无效，目前临床上治疗弓形虫病最有效的方法是使用磺胺类药物，早期诊断和早期治疗能收到较好效果，治疗时用药剂量要足，首次用量加倍，疗程要够，一个疗程需5～7 d，不能病情见好就停药，这种情况极易复发，继续治疗难度很大。临床用药较晚虽能控制临床表现和症状，但不能控制虫体进入组织形成包囊，造成病猪成为带虫猪，给猪群带来再次发病的风险。

卖完鸡，进鸡苗前怎样给鸡舍彻底消毒？

①肉鸡出栏后，清出鸡舍内所有废弃物，用高压水枪冲洗鸡舍干净，包括地面、网子、用具、墙壁、顶棚等。尤其注意清洗网上残留的鸡粪，也可用铁刷擦洗。

②饮水管线的消毒：将水管拆卸下来，放出残余的水，并用高压水枪冲洗，冲洗水箱等应用洗洁球或海绵擦洗，待全部擦洗干净后，再用1%～2%稀盐酸水溶液充满水线，浸泡24 h，放出浸泡液后用清水冲洗干净。

③待鸡舍干燥后，再用高压水枪喷洒消毒药水(可选用含碘或含氯消毒剂等)。喷洒应包括鸡舍内所有用具及鸡舍外周围环境及与本鸡舍有联系的设备、车辆等。

④再次检修设备，并调试使其全部处于完好状态，将鸡舍内所有用具放入鸡舍，用废报纸或胶带密闭所有门窗，后用固体甲醛或戊二醛薰蒸消毒。鸡舍密闭24 h 后，打开门窗通风。