长链非编码RNA LINC00858在胃癌中的表达及其临床意义

杜 娟， 陈亚妮， 史海燕， 王爱红， 殷松娜， 赵菊梅

延安大学医学院，陕西 延安 716000

最新癌症统计数据显示：全球范围内，每年约有1 033 701例新增胃癌患者(占癌症总发病率的5.7%)，是发病率位居第六位的肿瘤；相对于胃癌的发病率，其死亡率较高，继肺癌和结肠癌后死亡率位居第三位(每年约有78 265例胃癌患者死亡，占癌症总死亡率的8.2%)的恶性肿瘤[1]。在我国，胃癌每年的新增病例约41万，死亡病例约29.4万，是发病率仅次于肺癌、死亡率位居第三位(肺癌和肝癌之后)的恶性肿瘤[2-3]。胃癌较高的发病率和死亡率已使其成为威胁人类健康的公共卫生问题。然而，胃癌属于异质性疾病，其发病机制复杂，涉及遗传、饮食和地域等多种因素。在胃癌发生过程中，患者早期的症状不明显，临床上非侵入性检测方法相对缺乏，检出率较低；进入进展期后，手术及手术联合放化疗等治疗方式往往不能全面、有效地控制肿瘤的生长，患者的治疗和预后差。因此，如何提高胃癌的早期诊断、治疗和预后监测效率是一个亟待解决的问题。

蛋白质是机体生命活动的体现者，在过去的几十年中，肿瘤相关研究主要集中在蛋白质编码基因上。然而，蛋白质编码序列在基因组序列中的比例仅为2%左右，其他90%以上的转录序列，即非编码RNA(包括miRNA、siRNA、piRNA、LncRNA等)，并不产生蛋白产物。在过去很长一段时间内，非编码RNA的功能均未被发现，被认为是不具生物功能的“垃圾”产物。然而，随着研究手段的不断提高，miRNA、siRNA及长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)等被发现在机体生长、发育，细胞生长、凋亡，癌症发生、发展及转移过程中起着重要作用[4-6]，可能作为癌症诊断和治疗的潜在标志物和靶标[7]。

LncRNA是近年来研究较多的具有细胞组织特异性、时空特异性和种属特异性的基因转录产物，其片段长度通常>200 nt。在癌症发生、发展过程中，已有研究显示：LncRNA能够通过引导转录因子结合、参与表观遗传学修饰、介导miRNA沉默等方式调控肿瘤的发生、迁移[8]。然而，LncRNA种类和数量较多，大多数LncRNA的作用及其临床意义还不明确。在前期LncRNA表达研究中发现，基因间长链非编码RNA(intergenic LncRNA，LINCRNA)LINC00858(位于10q23.1上，长度为2 685 nt)在肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌、乳头状肾细胞癌和骨髓癌中的表达量较癌旁组织低，而在其他种类肿瘤组织中的表达量较癌旁组织高。且有报道显示，提高LINC00858的表达量能够促进骨肉瘤细胞、肺癌细胞和结肠癌细胞的生长[9-11]。然而，还未见LINC00858表达量与胃癌发生、发展相关的研究报道。本研究拟通过检测LINC00858在胃癌组织中表达量的变化，探讨LINC00858表达与胃癌患者临床病理特征的关系。

1 材料与方法

1.1 研究材料以实验室保存的20例人胃癌组织及其配对癌旁正常组织(经病理切片证实)为材料。所选20例患者经调查均无家族性遗传病史，且检查无其他部位原发肿瘤。患者基本情况如下：20例患者中，男10例，平均年龄64.9岁(46～86岁)；女10例，平均年龄67岁(48～78岁)。本研究通过科学研究伦理委员会批准，并遵守患者知情同意原则。

1.2 主要试剂与仪器总RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen公司(英国)；RNA反转录试剂盒购自Takara公司(日本)；实时荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂购自康润生物(中国)；qRT-PCR定量引物由本实验室设计(具体序列见表1)，奥科鼎盛生物科技有限公司(中国，杨凌)合成。研究所用qRT-PCR仪为Cobas Z480(Roche，美国)。

表1 qRT-PCR定量引物序列Tab 1 qRT-PCR primer sequences

1.3 TCGA数据分析首先，用在线软件Gene Expression Profiling Interactive Analysis(GEPIA，http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)分析不同类型肿瘤及其对应癌旁组织中LINC00858的表达情况。其次，用GEPIA分析胃癌患者LINC00858表达量与患者总生存期和无病生存期的关系。

1.4 总RNA的提取及cDNA的合成分别取各组织样品于预冷研钵中，液氮研磨，Trizol裂解各肿瘤及其配对癌旁组织细胞，氯仿萃取、异丙醇沉淀、75%乙醇洗涤后ddH2O溶解获得总RNA。酶标仪检测总RNA浓度和纯度(OD260/OD280)浓度，合格后，取1 μg总RNA按试剂说明书进行反转录(反转录所用引物为随机引物)合成cDNA。

1.5 qRT-PCR法检测LINC00858的表达量以U6为内部参照基因，按试剂说明书配制qRT-PCR反应液，qPCR检测患者肿瘤组织中LINC00858的相对表达量(以配对癌旁正常组织为对照)。qRT-PCR反应条件如下：95 ℃ 3 min，(95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s)×40个循环，95 ℃ 5 s，(60 ℃ 1 min，持续升温至95 ℃，荧光检测间隔为5 ℃)。LINC00858在肿瘤组织中的相对表达量用2-△△CT表示。

1.6 统计学方法采用Prism 7.0对数据进行分析，两组数据采用非参数Mann-WhitneyT检验，统计量用Mann-Whitney U表示；多组数据采用Kruskal-Wallis进行分析，统计量用Kruskal-Wallis statistic表示。P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1 在线数据分析LINC00858表达量在不同肿瘤患者组织中的表达变化用在线软件GEPIA分析LINC00858在不同肿瘤组织中的表达情况，结果如图1所示：LINC00858在三种肾癌组织(肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌、乳头状肾细胞癌)和骨髓癌中的表达量呈下降趋势，在其他多种肿瘤组织如胃癌、肺癌、结肠癌和膀胱癌等组织中表达量呈上升趋势。该结果提示，LINC00858的表达变化可能具有组织特异性：在肾脏相关肿瘤及骨髓癌中的特异性呈下降趋势，在胃癌及其他类型肿瘤中呈上升趋势。

注：ACC，腺样囊性癌；BLCA，膀胱癌；BRCA，乳腺癌；CESC，宫颈鳞癌和腺癌；CHOL，胆管癌；COAD，结直肠癌；DLBC，弥漫性大B细胞淋巴瘤；ESCA，食管癌；GBM，胶质母细胞瘤；HNSC，头颈鳞状细胞癌；KICH，肾嫌色细胞癌；KIRC，肾透明细胞癌；KIRP，乳头状肾细胞癌；LAML，急性髓细胞样白血病；LGG，脑胶质瘤；LIHC，肝癌；LUAD，肺腺癌；LUSC，肺鳞状细胞癌；OV，卵巢癌；PAAD，胰腺癌；PCPG，肾上腺癌；PRAD，前列腺癌；READ，直肠腺癌；SARC，软组织癌；SKCM，皮肤癌；STAD，胃癌；TGCT，睾丸癌；THCA，甲状腺；THYM，胸腺癌；UCEC，子宫内膜癌；UCS，子宫癌。

图1 LINC00858在不同肿瘤组织及其配对癌旁正常组织中的表达情况
Fig 1 Expression of LINC00858 in different tumor types compared with that in normal adjacent tissues

2.2 LINC00858表达量与胃癌患者生存期及临床分期相关性分析为明确LINC00858与胃癌发生、发展的关系，研究用GEPIA对LINC00858表达量变化与胃癌患者生存期间的关系进行了分析：低LINC00858表达患者的总生存期[LogrankP=0.046，P(HR)=0.047]和无病生存期[LogrankP=0.0076，P(HR)=0.0086]较高LINC00858表达患者长(见图2A、2B)。进一步对LINC00858表达量与胃癌患者临床分期进行分析发现，随着病情的发展，LINC00858在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ不同分期中表达量呈上升趋势，即LINC00858表达量越高，患者的临床分期越晚[Pr(>F)=0.0487](见图2C)。因此，胃癌患者肿瘤组织中LINC00858表达量升高可能促进疾病的进展，与患者的不良预后相关。

图2 LINC00858表达量与胃癌患者生存期、临床分期的关系 A：总生存期；B：无病生存期；C：临床分期Fig 2 Relationship of expression of LINC00858 with gastric cancer patients’ survival and clinical stage A: overall survival; B: disease-free survival; C: clinical stage

2.3 LINC00858在胃癌及其癌旁正常组织中的表达为进一步明确LINC00858在胃癌组织中的表达情况，研究用qRT-PCR法检测了20例胃癌患者的癌组织及其癌旁正常组织中LINC00858的表达量,结果显示不同胃癌患者LINC00858的表达变化存在差异(见图3A)，但在整体水平上，LINC00858在癌组织中的表达量较癌旁正常组织高(P=0.0230，见图3B)，即LINC00858表达量的升高与胃癌的发生呈正相关。

图3 LINC00858在不同患者的胃癌及其癌旁正常组织中的表达情况A：qRT-PCR分别检测20例胃癌患者癌组织及癌旁常组织中LINC00858的表达情况；B：整体水平上检测20例胃癌患者癌组织及癌旁正常组织中LINC00858的表达情况

Fig 3 Expression changes of LINC00858 in different gastric cancer tissues compared with that in normal adjacent tissuesA: expressions of LINC00858 in different gastric cancer patients’tumor tissue and normal adjacent tissues detected by qRT-PCR;B: overall expression of LINC00858 in gastric cancer tissues and normal adjacent tissues

2.4 LINC00858表达水平与胃癌患者临床病理参数相关性的分析不同性别、不同年龄胃癌患者LINC00858的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)；Ⅰ+Ⅱ期胃癌患者肿瘤组织中LINC00585表达水平较Ⅲ+Ⅳ期低，差异有统计学意义(P<0.0001,见表2)，即LINC00858表达水平可能与患者疾病的发展相关，LINC00858表达量增加对肿瘤的生长、侵袭和迁移具有促进作用。

3 讨论

目前，人类基因组中已经鉴定出的LncRNA数量超过56 000种，而根据其所处基因组位置的不同可分为LINCRNA、反义LncRNA、正义RNA、内含子LncRNA和双向LncRNA。在机体生长发育过程中，LncRNA的表达具有较高的组织、细胞特异性，不同类型的LncRNA可以作为信号分子、蛋白质相互作用的支架、诱饵以及靶向转录因子结合引导序列等，参与染色体修饰、基因转录、翻译和蛋白质相互作用[12]。

表2 胃癌组织中LINC00858表达水平与患者临床病理参数相关性分析Tab 2 Correlation analysis of LINC00858 expression level and clinicopathological parameters in gastric cancer patients

LncRNA在个体生长发育和疾病发生、发展中的研究相对于蛋白编码基因的研究较晚。但随着LncRNA功能研究的不断深入，人们发现LncRNA在不同组织、细胞发育的过程中也具有重要作用[13]，已有研究显示，LncRNA-ES1、LncRNA-ES2和Linc-ROR主要分布于多能性细胞中，与胚胎干细胞或iPS细胞多能性的维持相关；Bvht、Fendrr与心脏组织形成相关且主要存在于心脏组织中；HOTAIR和H19等LncRNA在肿瘤形成、发展过程中异常表达。在肿瘤研究中，大量研究结果显示，LncRNA的异常表达被证实与肿瘤的生长、侵袭和迁移相关。已有研究显示，H19、HOTAIR和MALAT1等LncRNA表达量增加与多种肿瘤的发生相关，提高H19、HOTAIR和MALAT1的表达量能够促进肝癌、乳腺癌、神经系统及呼吸系统相关癌症组织的生长、侵袭和迁移，而与上述LncRNA相反，GAS5、MEG3等LncRNA在多种肿瘤组织中的表达量呈下降趋势，提高GAS5及MEG3基因的表达量则可抑制肿瘤的生长[14]；2013年SONG等[15]通过LncRNA微阵列分析发现，人胃癌组织中有135个LncRNA分子的表达与正常组织相比存在异常。胃癌组织中异常LncRNA表达能够通过多种方式调节细胞的生长变化[16-17]，如LINC00152等能通过靶基因的结合调节细胞生长相关信号通路的活性进而调节胃癌细胞的增殖；HOTAIR能够通过组蛋白H3K27乙酰化修饰的调节促进胃癌组织细胞由表皮向间质细胞的转化；GAS5能够与miR-222、miR-23a等结合抑制胃癌细胞的增殖[18-19]。在LINC00858相关研究中，已有报道显示：LINC00858在结肠癌组织中的表达量升高，能够与AC02128.2、RP11-138J23.1等共同用于结肠癌的筛选[11]，在骨肉瘤中LINC00858能够通过miR-139-CDK14通路调节骨肉瘤细胞的生长[10]，而在非小细胞肺癌中LINC00858则可以竞争结合miR-422a抑制miR-422a的表达进而促进非小细胞肺癌的生长[9]。在本研究中，我们通过TCGA数据库中LINC00858表达量的分析发现，LINC00858在除肾脏相关肿瘤及骨髓癌以外的其他肿瘤组织中表达量均上调，且其表达量变化与胃癌患者的临床分期、总生存期及无病生存期存在相关性，然而，截止目前还未见LINC00858在胃癌中的作用及作用机制相关的报道。

总之，本研究通过TCGA数据库分析及20例胃癌患者胃癌组织及癌旁组织中LINC00858表达量的检测证实：LINC00858表达量升高与胃癌的发生、发展呈正相关，LINC00858在胃癌组织中的表达量较癌旁组织高，胃癌患者临床分期越晚，LINC00858表达量越高。LINC00858可能对胃癌的发生、发展具有调节作用，可作为胃癌治疗及预后监测的辅助检测指标。